前立腺癌骨転移の分子機構の解明

LNCaPを低アンドロゲン環境下に6ヶ月間継代しLNCaPのホルモン不応性株:LNCaP-SFを樹立した。LNCaP-SFをマウス骨に注入したところ、約10週でosteoblastic changeを主体とした骨腫瘍を形成した。ついで破骨細胞の活性抑制作用をもつビスフォスフォネートの抗腫瘍効果を検討した。In vitroにおいては濃度依存的、時間依存的に細胞増殖抑制効果が認められた。DNA fragmentation、および核の凝縮像(タネル染色陽性)が認められ、アポトーシスの関与が示された。Bcl2の抑制およびBaxの発現増強が認められ、濃度依存的にbcl-2/bax ratioの低下が認められた。さらにカスパーゼ3の活性化が認められ、カスパーゼ3のinhibitorを投与すると、殺細胞効果は抑制され、ある程度アポトーシスが回避されることが示唆された。ついでDNAの修復に促進的な作用を持つpoly(ADP)-ribose polymerase(PARP)の変化を検討したところ、ビスフォスフォネートの濃度依存的に分解されることが示され、アポトーシス関連因子の一連の動きが部分的ではあるが解明された。さらにビスフォスフォネートの投与により、receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL), parathyroid hormone related protein (PTHrP), matrix metalloprotease-2 (MMP-2)の抑制が認められ、これらの変化は破骨細胞の活性化の抑制、骨基質への細胞浸潤の抑制につながることが考えられ、いずれも転移巣の成立、進展を阻止するメカニズムを説明しうる変化と考えられた。ついでLNCaP-SF細胞をマウス骨(tibia)に移植し、1週目より第3世代のビスフォスフォネートであるYM-529を週1回10週間に渡り腹腔内に投与し腫瘍増殖抑制効果を検討した。投与量依存的に抗腫瘍効果が確認された。組織学的には、コントロールでは骨基質の形成を伴った腫瘍細胞の増殖が認められるのに対して、YM-529投与群では、骨髄内には腫瘍細胞の存在は認められるものの骨基質に浸潤する像は認められず、腫瘍細胞の増殖および骨基質への浸潤は抑制されたと考えられる。以上の結果から、新世代のビスフォスフォネートは破骨細胞の活性抑制ばかりでなく、腫瘍細胞に対する直接的な殺細胞効果、さらには腫瘍細胞から産生される骨吸収促進を促す因子に対する抑制効果を通して、骨転移巣に対する治療効果を発揮することが期待される。Bisphosphonates are well established for the management of cancer-induced skeletal complications.Recent studies suggest that bisphosphonates promote apoptosis of cancer cells as well as osteoclasts in bone metastatic sites.In the present study, to determine the direct effects of bisphosphonate on prostate cancer cells, we examined the effects of minodronate on prostatic cancer cell growth and the expression of apoptosis related proteins and osteoclastogenic factors.PC-3, DU 145 and LNCaP cells were treated with amino-bisphosphonate minodronate.Then proliferation, apoptosis and expression of bcl-2, bax, poly(ADP)-ribose polymerase(PARP), caspase-3, receptor activator of nuclear factor-kB ligand(RANKL), osteoprotegerin(OPG), matrix metalloproteinases-2(MMP-2), and parathyroid hormone related protein(PTHrP)were assessed. The proliferation of LNCaP, DU145 and PC-3 cells were inhibited by minodronate.DNA fragmentation and TUNEL positive nuclei were observed in minodronate treated PC-3 cells.Minodronate decreased bax expression and induced bcl-2 expression, caspase-3 activity and degradation of PARP in DU145 and PC-3 cells. Minodronate decreased expression of RANKL, PTHrP and MMP-2 in PC-3 cells.Antitumor effect of a new bisphosphonate, YM-529 was tested using a mouse model of bone tumor formation created by intratibial injection of hormone refractory LNCaP-SF cells.Antitumor effect of YM-529 on bone tumor formation was evident in a dose-dependent manner as no new osteoid formation was seen in mice treated with YM-529, while tumor cell invasion into bone matrix was remarkable in control mice.Our results suggest that bisphosphonate not only directly promotes prostate cancer cell apoptosis but also decreases pro-osteoclasfic gene expression in prostate cancer cells, and has the potential of an antitumor agent against hormone refractory prostate cancer.研究課題/領域番号:14571491, 研究期間(年度):2002-200

抗胎盤性アルカリフォスファターゼ抗体を用いた転移性精巣腫瘍の診断および治療

ヒトセミノーマ移植腫瘍におけるPLAP濃度はHeLa細胞移植腫瘍より高いにもかかわらずAnti-PLAP MAbの集積性は低く腫瘍イメージングは不可能であった。そこでこれまでにCEAなどにおいて報告されているIFN投与による細胞膜抗原の発現増強効果がヒトセミノーマ移植腫瘍のPLAPにおいて誘導されうるか否かを検討した。IFN投与により腫瘍組織内PLAP濃度は約50%増加した。抗体の腫瘍集積性は増強し抗体投与11日後において腫瘍イメージの改善をみた。しかしこの際の腫瘍/血流 比は1.0以下で抗体投与後早期から腫瘍イメージを捕えることは困難であり、INF投与量や投与方法に検討の余地を残した。ついでSCIDマウス精巣にHeLa細胞をinjectionすることにより精巣腫瘍およびそのリンパ節転移モデルを作製し、Anti-PLAP MAbの血行性およびリンパ行性投与における腫瘍集積性について検討した。この精巣腫瘍転移モデルでは肝、肺にヒトベータグロビンのPCR産物として検出されるmicrometastasisの存在が示された。そこでMacro-and micrometastasisに対するI-131 labeled Anti-PLAP MAbを用いたRadioimmunotherapyによる抗腫瘍効果を検討した。抗体の腫瘍集積性は精巣腫瘍よりもリンパ節転移巣に高く、これは病巣の大きさおよび抗原量の相違によるものと考えられた。また抗体の腫瘍集積の絶対量は血行性投与の方が勝っていた。リンパ行性投与によるニンパ節に対する優位な抗体の集積は認められずこの転移モデルにおいては腫瘍局在診断および標的治療に際し、抗体の血行性投与の有用性が示唆された。精巣腫瘍およびリンパ節転移巣に対しては腫瘍重量においてそれぞれ57%、95%の抑制率を認めたが、組織学的に残存腫瘍が確認された。またこのモデルにおいては腫瘍細胞注入後1週目より肝、肺にPCRによって検出可能であるmicrometastaisが認められたことより、これらの病巣に対する抑制率を検討したところ、それぞれ97%、81%であった。以上の結果よりPI標識抗体を用いたRadioimmunotherapyの抗腫瘍効果が確認されたが、PCRでのみ検出されるmicrometastasisに対しても同療法の治療限界が示唆された。We investigated significance of placental alkaline phosphase (PLAP) as a tumor marker for seminoma, and assessed a potential of PLAP as a targeting antigen for immunodetection and immunotherapy using anti-PLAP MAb. The monitoring of serum PLAP might be of value, as fluctuations in this marker provide information adout disease status and prognosis. Specific localization of anti-PLAP MAb to PLAP-producing xenografts was confirmed in a nude mouse model. In a SCID mouse model of testicular tumor and its lymph node metastases, localization of the MAb in lymph node metastases was more efficient than localization in testis tumors, suggesting the potential use of anti-PLAP MAb for radioimmunotherapy (RIT) on small metastatic foci of seminoma. However, efficacy of RIT on the metastaitc foci remains to be clarified since complete elimination of tumorcells was unlikely to occur in the mouse model treated with I-131 labeled anti-PLAP MAb.研究課題/領域番号:05671307, 研究期間(年度):1993-1995出典：「抗胎盤性アルカリフォスファターゼ抗体を用いた転移性精巣腫瘍の診断および治療」研究成果報告書　課題番号05671307(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

前立腺癌の局所進展に関わる因子: 神経浸潤とリンパ行性転移の分子生物学的解析

前立腺癌のリンパ節転移モデルとしてヒト前立腺癌由来細胞LNCap, PC-3を用いて、intratesticular inoculation model, or thotopic inoculation modelを作製し、細胞間ならびにモデル間での転移様式の相違を検討した。LNCapにおいてはintratesticular modelのほうが高い造腫瘍能、リンパ節転移能を示した。その機序としてLNCaPではin vitroにおいて高濃度のDHTとの接触で血管新生因子の発現増強が認められ、またintratesticular modelにおいてもVEGFの発現増強が確認された。一方PC-3細胞では両モデルとも高い造腫瘍能、リンパ節転移能を示し、LNCaP細胞で認められたDHTによる血管新生因子の発現増強は認められなかった。しかしlymphangiogenesisに関与するとされるVEGF-Cの発現は非常に強く、高頻度のリンパ節転移成立に関わっている可能性が示唆された。つぎに種々のヒト前立腺癌由来細胞(LNCaP, PC-3,DU145,TsUPR)を用いてneurotrophic factorsの発現を検討した。NGFはすべての細胞株で発現が認められたのに対し、bFGFの発現はPC-3,DU145,TSUPRで、また,NT3の発現はPC-3,DU145で強い傾向にあった。次いでDU145,TSUPRを用いてorthotopic inoculation modelを作製し、マウス前立腺内の神経組織との関わりについて組織学的に検討したところDU145のみに神経組織への浸潤像が観察され、neurotrophic factorの発現と神経浸潤すなわち被膜外進展との関連が示唆された。一方、臨床検体を用いた免疫組織化学的検討では、こられのfactorのなかでNGFの強発現が神経組織周囲へ浸潤する癌細胞において確認された。臨床検体におけるリンパ節転移の有無とangiogenic factor (VEGF-C)の発現との間に有意な相関は認められなかった。以上の結果から前立腺癌の局所進展すなわち神経浸潤およびリンパ節転移に関わる因子として動物実験においていくつかの因子の関わりが想定された。しかしこれらの因子の臨床検体における関与は必ずしも有意とは言えず、今後の検討課題と考えられた。In order to determine the factors responsible for local extension of prpstate cancer, orthotopic and intratesticular models, were created by injection of LNCaP cells or PC-3 cells into the prostate or testis of severe combined immunodeficient (SCID) mice. Messenger RNA expression ofangiogenesis-related and metastasis-related genes was analyzed by RT-PCR in materials obtained from xenografts and their metastases. The intratesticular model of LNCaP cells showed a higher incidence of tumor formation and lymph node metastasis, while PC-3 cells were highly tu\u27morigenic and metastastic in both models. Androgen enhanced the in vitro mRNA expression of angiogenesis-related genes in LNCaP cells, but not in PC-3 cells. Higherexpression of metastasis-related genes, including uPA system, MMPs, and VEGF-C in PC-3 cells than LNCaP cells were demonstrated in vivo. Then, expression of neurotrophic factors in several prostate cancercell lines (LNCaP, PC-3, DU145, TSUPR) was investigated.NGF was expressed in all fourlines, while bFGF in PC-3, DU145 and TSUPR, and NT3in PC-3 and DU145. Only DU145 created invasion to neural plexus in orthotopic model, suggesting relationship between the expression of these factors and perineural invasion. Thus, the orthotopic/ intratesticular model wifti prostate cancer cells appears to be suitable for studying the mechanisms of tumor local extension and metastasis. In clinical settings, NGF expression of prostate cancer cells infiltrating into perineural space was demonstrated. However, no con-elation of VEGF-C expression to lymph node metastasis was shown.Discordance between animal models and clinical settings should be further investigated.研究課題/領域番号:12671523, 研究期間(年度):2000-2001出典：「前立腺癌の局所進展に関わる因子: 神経浸潤とリンパ行性転移の分子生物学的解析」研究成果報告書　課題番号12671523 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

睾丸腫瘍における胎盤様アルカリフォスファターゼ(PCAP-like)の研究

金沢大学医学部附属病院1)精巣腫瘍ことにセミノ-マ組織中には正常精巣に比べて約60培の胎盤性アルカリフォスファタ-ゼ(PLAP)活性が認められた。この酵素活性は胎盤由来のPLAPと比較してglycosylation,electric chargeの点で相違を認め、いわゆるPLAPーlike enzymeに分類されると考えられた。2)喫煙によって上昇する血清PLAP活性はglycosylation,electric charge,hydrophobicityの点で精巣腫瘍由来のPLAP活性(PLAPーlike)に類似していた。3)セミノ-マ組織のPLAPーlike免疫組織化学染色においては転移性リンパ節も含めてすべて陽性であった。4)血清PLAPーlikeのセミノ-マにおける陽性率はstage Iで42%、stage IIーIIIで90%であり、非セミノ-マのそれらに比べて明らかに高率であった。これは両腫瘍間におけるPLAPーlikeの組織レベルの差を反映していることが明らかとなったが、腫瘍体積の増加に伴って陽性率は高くなる傾向が認められた。比較的短い血中半減期およびhigh stageにおける高い陽性率より、PLAPーlikeはセミノ-マに対する治療効果の判定および経過観察において有用な腫瘍マ-カ-であると考えられた。5)血清診断に用いられた抗PLAPモノクロナ-ル抗体(HPMSー1)はPLAPを産生するヌ-ドマウス移植可腫瘍に集積性を認め、臨床における画像診断への応用の可能性が示唆された。The role of PLAP-like as a tumor marker was evaluated in 62 cases of testicular germ cell tumors. Positive rates in different histology as well as stages were as follows ; seminoma, stage I : 42%, stages II-III, 90%, nonseminoma, stage I : 17%, stages II-III : 44%. Serum PLAP-like values in stages II-III were significantly higher than those in stage I. Tissue PLAP-like concentrations in 32 seminomas and 15 nonseminomas were also investigated. Significant differences in PLAP-like concentrations were disclosed between seminoma tissues and nonseminoma tissues as well as between the cases with elevated serum levels and the cases with normal serum levels. Serum values in stage I turned to normal within a week after orchiectomy. Half-life in the circulation was calculated at 2 days. Four out of 93 cases(4.3%), 17 of 594 samples(2.9%)in a follow-up study were regarded as false positive. Thus PLAP-like appears to be a useful marker for seminoma.To investigate a potential use of an anti-PLAP monoclonal antibody for detecting tumors, HPMS-1 MAb labeled with I-125 was injected to athymic mice bearing tumors producing PLAP. Although accumulation rate(%dose/g tissue)was gradually decreased in the tumor, clearance of the MAb in other organs were more rapidly. Thereby an increase of tumor/organ ratio with time was observed, resulted in a clear tumor imaging after 9 days of injection. PLAP concentrations in the transplanted tumors were lower than those of primary seminomas or metastatic lymphnodes of seminoma. Therefore a potential use of the anti-PLAP MAb(HPMS-1)for detecting metastatic lesion of seminoma could be expected.研究課題/領域番号:01570883, 研究期間(年度):1989 – 1991出典：研究課題「睾丸腫瘍における胎盤様アルカリフォスファタ-ゼ(PCAPーlike)の研究」課題番号01570883（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-01570883/015708831991kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

抗PSA抗体をキャリアーとした転期性前立腺癌に対する標的放射線・遺伝子治療

金沢大学医学部附属病院in vitroにおけるCD遺伝子導入前の5FUに対する感受性はLNCaP>DU-145>PC-3であった。FuGENE6法によりCD遺伝子導入後の5FCによる殺細胞効果はLNCaPのみに認められた。G418を用いてCD遺伝子導入細胞を選択した後、5FCによる殺細胞効果を検討すると、LNCaP/CD>DU-145/CD>PC-3/CDとなり5FUに対する感受性と一致した。SCIDマウス精巣にLNCaPあるいはLNCaP/CDを移植してin vivoモデルを作成した。5FU:15mg/kg/dayおよび30mg/kg/day投与群では、コントロール群と比べ有意な腫瘍増殖の抑制が認められた。つぎにLNCaP/CDを用いたモデルにおいて5FC投与時の腫瘍組織内5FU濃度について検討した。5FC:500mg/kg/day連日投与9日目の腫瘍組織内の5FU濃度は、5FU:15mg/kg/day投与群のそれと同等であった。その際の血中5FU濃度は、5FU:5mg/kg/day投与群のそれと同程度であった。ついでLNCaP/CDモデルでの5FC投与群ではコントロール群に比べ有意な抗腫瘍効果が認められ5FU:15mg/kg/day投与群とほぼ同程度の抗腫瘍効果が得られた。CD/5FC療法による体重変化を他の群と比較したところ、コントロール群やintactLNCaPにおける5FC単独投与群と比較して有意差は認められなかった。一方5FU全身投与では濃度依存性に抗腫瘍効果が認められたが、明らかな体重減少を伴ったことよりCD/5FC療法の有用性が示唆された。つぎにPSAを標的抗原として抗PSA抗体にI一131を標識しRadioimmunotherapy(RIT)との併用療法の可能性について検討した。LNCaP/CD移植48時間後より5FC:500mg/kg/dayを9日間連日腹腔内投与した。さらに腫瘍移植96時間後にI-131標識抗PSA抗体:20mCi/mouseを投与し、抗体の経時的分布および抗腫瘍効果を評価した。I-131標識抗PSA抗体(20mCi/mouse)単独投与時のLNCaP/CD移植腫瘍に対する抗腫瘍効果は認められなかった。抗体の経時的分布:per cent injected dose/gram tissueおよびtumor/tissue ratioにおいては腫瘍特異的な集積性に乏しかった。I-131標識抗PSA抗体(20mci/mouse)とCD/5FCとの併用においても明らかな抗腫瘍効果は認められなかった。今回の実験の条件設定ではRIT単独では抗腫瘍効果は認められずI-131標識抗PSA抗体の投与量に関してdose escalation studyが必要と考えられる。また抗PSA抗体の腫瘍集積性は低く,血液中の半減期も長いため抗体の特性に問題があると思われる。Sensitivity of human prostate cancer cell lines : LNCaP, DU-145, PC-3 to 5FU in vitro was as follows ; LNCaP>DU-145>PC-3. Cytotoxic effect of 5FC to these cell lines to which cytosine deaminase gene was transfected, was shown for only LNCaP/CD, mostly depending on the efficiency of gene transfection. The order of sensitivity to 5FC was the same as that of intact cell lines to 5FU following selection of these cells with G418. Then we developed an in vivo model by injection of LNCaP or LNCaP/CD cells into the testis of SCID mice. A significant anti-tumor effect was shown by systemic administration of 15 mg/kg, 30 mg/kg of 5FU with mild weight loss. Also equivalent anti-tumor effect was shown for LNCaP/CD tumor by administration of 5FC without weight loss. The tissue and serum concentration of 5FU corresponded to the anti-tumor effect and the adverse reaction observed. This might represent the advantages of the gene therapy. Then the potential of combination with radioimmunotherapy was investigated. I-131 labeled anti-PSA Ab was injected following 5FC administration to enhance anti-tumor effect. However, no anti-tumor effect was obtained in combination of RIT and gene therapy, probably due to poor accumulation of the Ab to tumors. We need dose escalation study of I-131 labeled Ab and to improve the specificity of the Ab as well.研究課題/領域番号:09470344, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：研究課題「抗PSA抗体をキャリアーとした転期性前立腺癌に対する標的放射線・遺伝子治療 」課題番号09470344（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-09470344/094703441998kenkyu_seika_hokoku_gaiyo//）を加工して作

Successful Treatment of a Large Superficial Bladder Cancer with Neoadjuvant Arterial Infusion Chemotherapy: A Case Report

We present a case in which neoadjuvant arterial infusion chemotherapy was effective in treating a large superficial bladder cancer. A 50-year-old male was admitted to the Kanazawa Medical Center with the complaint of dizziness. The patient exhibited severe anemia, and his computer tomography showed a large bladder tumor. Cystoscopy revealed a large papillary tumor. Magnetic resonance imaging showed no muscle invasion and no metastasis. To avoid a prolonged operation time and excessive blood loss, we performed neoadjuvant arterial infusion chemotherapy for tumor volume reduction before transurethral resection of the bladder tumor (TUR-BT). The arterial infusion chemotherapy was performed twice, and the tumor size gradually reduced from 275 to 28 cm3. After neoadjuvant chemotherapy, TUR-BT was safely performed without blood transfusion. The tumor was staged as T1 with G1. This is the first report demonstrating that neoadjuvant arterial infusion chemotherapy is effective in treating large superficial bladder cancer and is a possible strategy for bladder preservation

Four year clinical statistics of iridium-192 high dose rate brachytherapy

金沢大学医学部附属病院泌尿器科Background: We evaluated the efficacy and complications of high dose rate (HDR) brachytherapy using iridium-192 (192Ir) combined with external beam radiotherapy (EBRT) in patients with prostate cancer. Methods: Ninety-seven patients underwent 192Ir HDR brachytherapy combined with EBRT at our institution between February 1999 and December 2003. Of these, 84 patients were analysed in the present study. 192Ir was delivered three times over a period of 2 days, 6 Gy per time, for a total dose of 18 Gy. Interstitial application was followed by EBRT at a dose of 44 Gy. Progression was defined as three consecutive prostate-specific antigen (PSA) rises after a nadir according to the American Society for Therapeutic Radiology and Oncology criteria. The results were classified into those for all patients and for patients who did not undergo adjuvant hormone therapy. Results: The 4-year overall survival of all patients, the nonadjuvant hormone therapy group (NAHT) and the adjuvant hormone therapy group (AHT) was 87.2%, 100%, and 70.1%, respectively. The PSA progression-free survival rate of all patients, NAHT, and AHT was 82.6%, 92.0%, and 66.6%, respectively. Of all patients, the 4-year PSA progression-free survival rates of PSA < 20 and PSA ≥ 20 groups were 100%, and 46.8%, respectively. According to the T stage classification, PSA progression-free survival rates of T1c, T2, T3, and T4 were 100%, 82.8%, 100%, and 12.1%, respectively. Prostate-specific antigen progression-free survival rates of groups with Gleason scores (GS) < 7 and GS ≥ 7 were 92.8% and 60.1%, respectively. Of NAHT, PSA progression-free survival of PSA < 20 was 100% vs 46.8% for PSA ≥ 20, that of T1c was 100% vs 75% for T2, and that of GS < 7 was 100% vs 75% for GS ≥ 7. No significant intraoperative or postoperative complications requiring urgent treatment occurred except cerebellum infarction. Conclusions: 192Ir HDR brachytherapy combined with EBRT was as effective as radical prostatectomy and had few associated complications