Strategies for Efficient Expression of Heterologous Monosaccharide Transporters in Saccharomyces cerevisiae

ABSTRACT: In previous work, we developed a Saccharomyces cerevisiae strain (DLG-K1) lacking the main monosaccharide transporters (hxt-null) and displaying high xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase activities. This strain proved to be a useful chassis strain to study new glucose/xylose transporters, as SsXUT1 from Scheffersomyces stipitis. Proteins with high amino acid sequence similarity (78-80%) to SsXUT1 were identified from Spathaspora passalidarum and Spathaspora arborariae genomes. The characterization of these putative transporter genes (SpXUT1 and SaXUT1, respectively) was performed in the same chassis strain. Surprisingly, the cloned genes could not restore the ability to grow in several monosaccharides tested (including glucose and xylose), but after being grown in maltose, the uptake of C-14-glucose and C-14-xylose was detected. While SsXUT1 lacks lysine residues with high ubiquitinylation potential in its N-terminal domain and displays only one in its C-terminal domain, both SpXUT1 and SaXUT1 transporters have several such residues in their C-terminal domains. A truncated version of SpXUT1 gene, deprived of the respective 3 '-end, was cloned in DLG-K1 and allowed growth and fermentation in glucose or xylose. In another approach, two arrestins known to be involved in the ubiquitinylation and endocytosis of sugar transporters (ROD1 and ROG3) were knocked out, but only the rog3 mutant allowed a significant improvement of growth and fermentation in glucose when either of the XUT permeases were expressed. Therefore, for the efficient heterologous expression of monosaccharide (e.g., glucose/xylose) transporters in S. cerevisiae, we propose either the removal of lysines involved in ubiquitinylation and endocytosis or the use of chassis strains hampered in the specific mechanism of membrane protein turnover.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Transporte e fermentação de xilose, celobiose e xilobiose por leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017.Saccharomyces cerevisiae é o organismo mais amplamente utilizado pela indústria de produção de bioetanol, mas não consegue fermentar eficientemente alguns açúcares presentes em hidrolisados da biomassa ligninocelulósica. Uma vez que o limitado transporte de xilose e a inexistência de vias de utilização de xilobiose e celobiose são uns dos principais desafios a serem superados para uma eficiente fermentação destes hidrolisados, neste trabalho identificamos novos transportadores de açúcares e enzimas provenientes de leveduras que naturalmente conseguem utilizar hidrozado de biomassa vegetal, como Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum, Meyrozyma guilliermondii e Candida tropicalis. Uma linhagem de S. cerevisiae hxt-nula, sem os principais transportadores de hexose (hxt1-hxt7 e gal2), mas com altas atividades de xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, foi transformada com plasmídeos de uma biblioteca genômica de Sc. stipitis ou, alternativamente, com genes de transportadores de açúcares selecionados a partir dos genomas publicados de Sp. passalidarum e Sp. arborariae. Cinco genes permitiram fermentação de xilose e glicose pelas linhagens recombinantes: três genes de S. stipitis (SsXUT1, SsHXT2.6 e SsQUP2), e duas versões truncadas de transportadores provenientes de Sp. arborariae e Sp. passalidarum (tSaXUT1 e tSpXUT1, respectivamente), sendo que o transportador tSpXUT1 foi o que permitiu o melhor desempenho fermentativo com xilose de todos os transportadores clonados. Além disso, novos genes para transportadores e enzimas necessárias para o consumo de xilobiose e celobiose também foram expressos em S. cerevisiae, incluindo uma enzima intracelular (SpBGL2) proveniente de Sp. passalidarum com atividade ß-glicosidase e ß xilosidase. A co-expressão de genes de transportadores (MgCBT2 e CtCBT1) provenientes de M. guilliermondii e C. tropicalis, permitiu o consumo de celobiose por S. cerevisiae. A combinação do transportador MgCBT2 com a enzima SpBGL2 permitiu a eficiente fermentação de celobiose por S. cerevisiae, atingindo rendimento máximo de etanol a partir desta fonte de carbono. Portanto, os resultados obtidos ressaltam a importância dos transportadores de açúcares para a eficiente produção de bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica por leveduras S. cerevisiae recombinantes.Abstract : Saccharomyces cerevisiae is the most widely organism used by bioethanol production industry, but it can not ferment efficiently some sugars present in ligninocellulosic biomass hydrolysates. Since limited xylose transport and the lack of ways to using xylobiose and celobiose are one of main challenges to be overcome for efficient hydrolyzates fermentation, in this work we identify new sugar transporters and enzymes from yeasts that naturally can use plant biomass, such as Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum, Meyrozyma guilliermondii and Candida tropicalis. A S. cerevisiae strain without the major hexose transporters (hxt1-hxt7 and gal2), but with high xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase activities, was transformed with plasmids from Sc. stipitis genomic library or, alternatively, with sugar transporter genes selected from published Sp. passalidarum and Sp. arborariae genomes. Five genes allowed xylose and glucose fermentation by recombinant strains: three Sc. stipitis genes (SsXUT1, SsHXT2.6 and SsQUP2), and two truncated transporters versions from Sp. arborariae and Sp. passalidarum (tSaXUT1 and tSpXUT1, respectively), and tSpXUT1 transporter was the one that allowed the best xylose fermentation desempenho of all cloned transporters. In addition, new genes for transporters and enzymes required for xylobiose and celobiose consumption were also expressed in S. cerevisiae, including an intracellular enzyme (SpBGL2) from Sp. passalidarum with ß-glucosidase and ß-xylosidase activity. The co-expression of the transporter genes (MgCBT2 and CtCBT1) from M. guilliermondii and C. tropicalis with intracellular enzyme, allowed celobiose consumption by S. cerevisiae. The combination of MgCBT2 transporter with SpBGL2 enzyme, allowed efficient celobiose fermentation by S. cerevisiae, achieving maximum yield of ethanol from this carbon source. Therefore, the results obtained highlight sugar transporters importance for efficient bioethanol production from lignocellulosic biomass by recombinant yeasts S. cerevisiae

Engenharia genômica de leveduras Saccharomyces cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012.As leveduras Saccharomyces são amplamente utilizadas na produção de álcool combustível graças à sua capacidade de adaptação ao ambiente industrial, e à habilidade de fermentar açúcares eficientemente. A sacarose, açúcar majoritário nos mostos utilizados no Brasil, é um dissacarídeo hidrolisado pela enzima invertase, que é codificada pelos genes SUC e secretada pelas leveduras. Dessa forma, obtêm-se, no meio, glicose e frutose, monossacarídeos que são transportados para o interior da célula e fermentados até etanol e CO2. No entanto, recentemente foi descrita uma outra via para a eficiente fermentação de sacarose envolvendo o transporte ativo do açúcar para o interior da célula, mediado pela permease AGT1, e sua hidrolise pela invertase intracelular. No presente trabalho uma linhagem industrial da levedura S. cerevisiae, que tende a dominar as dornas de fermentação, foi modificada utilizando técnicas de engenharia genômica visando a fermentação da sacarose através da sua captação direta. A estratégia envolveu sobre-expressar a invertase intracelular (iSUC2) e utilizar o gene da permease AGT1 (flanqueado por sequências que permitem sua sobre-expressão) para deletar a outra cópia do gene SUC2 presente no genoma diploide da levedura, impedindo portanto sua hidrólise extracelular. Embora as modificações genéticas tenham sido realizadas com sucesso, os resultados indicam que na linhagem industrial modificada (iSUC2 + suc2::AGT1) existem outros genes SUC que expressam a invertase extracelular.Abstract : Saccharomyces yeasts are widely used in the production of fuel ethanol due to its capacity to adapt to the industrial environment, and the ability to ferment sugars efficiently. Sucrose, the major sugar in musts used in Brazil, is a disaccharide hydrolyzed by the enzyme invertase secreted by yeasts and encoded by the SUC genes. Thus, glucose and fructose are obtained and transported into the cell in order to be fermented into ethanol and CO2. However, another pathway for efficient sucrose fermentation was recently described involving the active transport of the sugar into the cell mediated by the AGT1 permease, and its hydrolysis by the intracellular invertase. In this work an industrial S. cerevisiae yeast strain, which tends to dominate the fermentation vats, was modified using genomic engineering techniques aiming the fermentation of sucrose by its direct uptake. The strategy involved over-expression of the intracellular invertase (iSUC2) and the use of the AGT1 permease gene (flanked by sequences that allow its over-expression) to delete the other copy of the SUC2 gene present in the diploid genome of yeasts, preventing its extracellular hydrolysis. Although the genetic modifications were performed successfully, the results indicate that in the modified industrial strain (iSUC2 + suc2::AGT1) there are other SUC genes that express the extracellular invertase