Mechanisms of Post-hemorrhagic Hydrocephalus after Germinal Matrix Hemorrhage

The inherently fragile vasculature of the germinal matrix is susceptible to rupture, possibly as a result of hemodynamic and cardiorespiratory instability associated with prematurity. Germinal matrix hemorrhage is a leading cause of morbidity and mortality in preterm and/or very low birthweight infants, and post-hemorrhagic hydrocephalus is major consequence of severe grade hemorrhages. Chronic post-hemorrhagic hydrocephalus treatment involves surgical insertion of shunts, which are costly and prone to complications. Thus, a safe non-invasive therapeutic approach towards post-hemorrhagic hydrocephalus clinical management would significantly improve the quality of life for this patient population. Thrombin, cerebroventricular blood clots, and iron have been identified as causative factors of hydrocephalus formation. Thrombin stimulates proteinase-activated receptors, leading to subsequent mTOR activation and extracellular matrix protein proliferation, which possibly obstruct the cerebroventricular system. Blood clots may directly impair cerebrospinal fluid circulation and absorption. PPARγ stimulation enhances micgroglial/macrophage phagocytosis of erythrocytes via CD36 scavenger receptor, augmenting clot resolution and improving outcomes after adult cerebral hemorrhage. Additionally, lysed erythrocytes and metabolized hemoglobin release iron, which is associated with brain injury after adult cerebral hemorrhage and contribute to post-hemorrhagic hydrocephalus development. The central aim of this proposal is to determine the role of activated thrombin/PAR-1/mTOR pathway as well as the role of hematoma resolution by PPARγ/CD36 and iron chelation by Deferoxamine in hydrocephalus development after germinal matrix hemorrhage. Direct thrombin inhibition reduced short-term mTOR activation and ameliorated long-term post-hemorrhagic hydrocephalus development, neurocogntive deficits, and extracellular matrix protein proliferation, although PAR-1 inhibition alone did not achieve the same therapeutic benefits. PPARγ stimulation improved short-term hematoma resolution, which was reversed by PPARγ antagonism and CD36 knockdown. PPARγ stimulation attenuated long-term neurocognitive deficits and post-hemorrhagic hydrocephalus, which was reversed by PPARγ antagonism. Acute and delayed iron chelation also reduced long-term post-hemorrhagic hydrocephalus development, neurocognitive deficits, and extracellular matrix protein proliferation. Thus, thrombin/PAR/mTOR pathway inhibition, enhanced PPARγ/CD36 mediated hematoma resolution, and iron chelation significantly ameliorated short and long-term brain sequelae after germinal matrix hemorrhage and are clinically viable therapeutic targets warranting further investigation

Mikrokalorimetrische Studien zum Verständnis der thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften von Inhibitoren der Blutgerinnungskaskade

Genauere Kenntnisse über die Struktur-Wirkungs-Beziehungen sind essentiell für das Design neuer Leitstrukturen und deren Optimierung. Mittlerweile wird vielfach versucht, eine Leitstruktur unter zu Hilfenahme der Kristallstruktur des Zielproteins, das gehemmt werden soll, zu finden und zu verbessern. Dabei wird häufig vergessen, dass die Affinität nicht allein auf strukturellen Aspekten beruht, sondern eine komplexe Kombination aus Struktur und Dynamik und eine Wechselwirkungsbilanz zwischen Solvenz und Protein ist. Die einfachste Methode, um einen Überblick über alle thermodynamischen Daten zu bekommen, stellt die Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) dar. ITC ist die einzige Methode, mit der die Enthalpie, die Entropie, die Freie Energie und die Bindungskonstante mit einem Experiment bestimmt werden können, wobei die Entropie als Differenz berechnet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die folgenden Liganden für genauere strukturelle und thermodynamische Studien in Bezug auf ihre Bindung sowohl gegenüber Thrombin als auch gegenüber Trypsin ausgewählt. Von den ausgewählten Liganden konnten sechs Strukturen kristallographisch im Komplex mit Trypsin und drei Strukturen im Komplex mit Thrombin gelöst werden. Zusätzlich wurden die Strukturen von drei weiteren Thrombin-Inhibitor-Komplexen bestimmt. Anhand der Kristallstrukturen der Liganden 1 bis 7 lässt sich abschätzen, dass jeweils eines der Enantiomere auf jeden Fall etwas besser bindet als das andere, da in allen Strukturen nur das (+)-Enantiomer in die Elektronendichte eingebaut werden konnte, obwohl immer das Racemat für die Kristallisation verwendet wurde. Scheinbar reicht schon der vermutlich in einigen Beispielen gegebene geringere Affinitätsunterschied aus, damit nur das stärker bindende Enantiomere in der Kristallstruktur zu erkennen ist. Die Überlagerung der Liganden 1 - 7 im Komplex mit Trypsin zeigt bei den Liganden keine Unterschiede bei der Bindung im Bereich des starren Grundgerüsts, es sind aber deutliche Abweichungen bei der Piperonylgruppe zu verzeichnen. Die Liganden unterscheiden sich in erster Linie nur in Bezug auf den Alkyl- bzw. Arylsubstituenten, der in die S2-Tasche zeigt. Hierin begründen sich auch die sehr ähnlichen Affinitäten gegenüber Trypsin. Die S2-Tasche ist bei Trypsin nach oben hin nicht begrenzt und somit scheint es von untergeordneter Bedeutung zu sein, welche Substituenten die Liganden in dieser Position tragen. Für 1 ist bekannt, dass sich beide Enantiomere bei der Bindung gegenüber Trypsin nur um den Faktor 22 in ihrer Affinität unterscheiden. Das lässt sich ebenfalls mit der nach oben offenen Bindetasche erklären. Ebenso kann davon ausgegangen werden, dass auch für die anderen Liganden der Affinitätsunterschied zwischen beiden Enantiomeren im gleichen Bereich liegt wie bei Ligand 1. Die Titrationskurven deuten ein solches Verhalten an. Die Überlagerung der drei Liganden im Komplex mit Thrombin zeigt noch geringere Unterschiede in deren Orientierung. Ein Grund dafür ist eine zusätzliche Wasserstoffbrücke zwischen der Hydroxylgruppe des Tyr60A und der Piperonylgruppe, die dadurch in einer Bindungskonformation fixiert wird abweichend von der Situation im Trypsin. Bei Thrombin spielt die Größe der Alkyl- bzw. Arylgruppe eine entscheidende Rolle für die erzielte Bindungsaffinität. Im Gegensatz zu Trypsin ist der zugängliche Raum der S2 Tasche bei Thrombin durch den 60er-Loop begrenzt. Aus früheren Studien ist bekannt, dass die sterische Hinderung durch den Tyr60A-Trp60D-Teil des 60er-Loops einer der Gründe für die enge Substratspezifität von Thrombin ist. Somit wirkt sich eine zu große Gruppe in dieser Position negativ auf die Affinität aus. Entsprechend fallen die Affinitäten für die Liganden 4, 5 und 7 gegenüber Thrombin im Vergleich zu den Liganden 1, 2 und 3 deutlich ab. Der 60er Loop und die somit begrenzte S2-Tasche ist auch der Grund für den großen Affinitätsunterschied zwischen den Enantiomeren des Liganden 1. Die extrem hohe Selektivität dieses Liganden gegenüber Thrombin kann dadurch erklärt werden, dass das besser bindende Enantiomer mit seiner Isopropylgruppe absolut optimal in die S2-Tasche von Thrombin passt. Dadurch erzielt das (+)-1 Enantiomer eine Affinität von 7 nM, wohingegen das andere Stereoisomer mit 5600 nM noch schlechter als die Derivate 4, 5 und 7 bindet. Letztere Werte beziehen sich auf die Racemate, doch legen die Titrationskurven nahe, dass beide Enantiomere dieser drei Liganden mit sehr ähnlicher Affinität an Thrombin binden (Differenz um einen Faktor von 10 - 20)

Kristallstrukturanalyse und Entwicklung von Computermodellen zur Beschreibung der Selektivität von Enzymen am Beispiel der Carboanhydrase

Ein Ziel der modernen Wirkstoffforschung ist die Entwicklung von Arzneistoffen, die selektiv mit einem Zielprotein wechselwirken. Dadurch sollen Nebenwirkungen in einem frühen Stadium der Entwicklung minimiert, wenn möglich sogar ausgeschlossen werden. Bei der strukturbasierten Entwicklung von Wirkstoffen wurden im Falle der Carboanhydrase (CA) die physikochemischen Eigenschaften von CA-Inhibitoren mit den biologischen Affinitäten an drei Isoenzymen (CA I, CA II, CA IV) korreliert. Mit den daraus erhaltenen 3D-QSAR-Modellen können diejenigen physikochemischen und strukturellen Eigenschaften der Verbindungen bestimmt werden, die die biologische Aktivität im Hinblick auf ein Isoenzym beeinflussen. Mit zwei verschiedenen Ansätzen wurden selektive 3D-QSAR-Modelle erhalten, mit deren Hilfe anhand von Konturdiagrammen Bereiche ermittelt werden können, die für eine bestimmte physikochemische Eigenschaft (sterische, elektrostatische, hydrophobe, Akzeptor, Donor) die Selektivität hinsichtlich eines Isoenzyms erhöhen oder erniedrigen. Aus dieser reinen Liganden-basierten Analyse konnten dennoch Rückschlüsse auf die Gegebenheiten in der umgebenden Bindetasche gezogen werden. Aber nicht nur die Auswertung von Ligandeninformationen kann wichtige Hinweise für die Entwicklung selektiver CA-Inhibitoren liefern. Die Auswertungen von Kristallstrukturen der CA bestätigten diese aus reiner Ligandeninformation erhaltenen Selektivitätsmodelle und lieferten zusätzliche Informationen für die Entwicklung selektiver Verbindungen. Ferner konnte anhand eines Homologiemodells der C AIX gezeigt werden, dass die Modellierung von Enzymen, deren Kristallstrukturaufklärung sich als schwierig erweist, durchaus nützliche Hinweise für den strukturbasierten Entwurf bzw. die Optimierung von Liganden liefern kann. Um potentielle neue (selektive) Leitstrukturen zu finden, können neben dem experimentellen Hochdurchsatz-Screening virtuell am Computer Datenbanken mit gespeicherten Molekülbibliotheken durchmustert werden. Die korrekte Vorhersage des Bindungsmodus und die korrekte Abschätzung der Bindungsaffinität der platzierten Moleküle ist entscheidend für die erfolgreiche Identifizierung von neuen Leitstrukturen. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass für CA-Inhibitoren mit einem rigiden Ringgerüst und mit bekannter Kristallstruktur der Bindungsmodus korrekt vorhergesagt werden konnte. In den Fällen, in denen die Bewertungsfunktionen der Dockingprogramme in der Affiniätsvorhersage der Verbindungen fehlschlagen, konnte durch die Kombination mit den zuvor erhaltenen 3D-QSAR-Modellen die Affinität dieser gedockten Verbindungen richtig abgeschätzt werden. Darüber hinaus wurde in Datenbanken und in der Literatur nach potentiellen neuen CA-Inhibitoren gesucht und ihre Bindung ließ sich biochemisch in einem Assay bestätigen. Eine Platzierung in der Bindetasche von CA II ermöglicht die korrekte Abschätzung der Affinität. Bei der Optimierung von Leitstrukturen/Wirkstoffen ist es sehr schwierig Wechselwirkungen mit Proteinen vorherzusagen beziehungsweise abzuschätzen, die sich in ihrer Sequenz und Funktion stark von dem Ausgangsprotein unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass Cyclooxygenase (COX)-2-selektiven Verbindungen (Valdecoxib, Celecoxib) ebenfalls CA hemmen. Obwohl beide Enzyme ? COX und CA - unterschiedliche biologische Funktionen besitzen, weisen beide Enzyme lokale Bereiche im aktiven Zentrum mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften auf, so dass die Bindung von Celecoxib und Valdecoxib an beiden Enzymen ermöglicht wird. Diese Kreuzreaktivität von Celecoxib und Valdecoxib wurden durch kinetische Daten und mit der Kristallstruktur von Celecoxib im Komplex mit CA II belegt