Análise da participação do transportador ZIP3 na virulência de Cryptococcus gattii

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, doença fúngica que afeta humanos e outros animais. Essa patologia é caracterizada por uma infecção pulmonar primária, com possível disseminação sistêmica posterior e resultando no quadro potencialmente letal de meningoencefalite. Nesse contexto, macrófagos alveolares representam a primeira linha de defesa do hospedeiro e, por meio da fagocitose, expõem as leveduras a um ambiente hostil caracterizado por um pH ácido, presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, peptídeos antimicrobianos e privação de nutrientes. Em contrapartida o patógeno expressa transportadores de alta afinidade, como os membros da família ZIP, para prover a célula da levedura com todos os componentes necessários para se desenvolver neste ambiente. O transportador codificado pelo gene ZIP3 de C. gattii é ortólogo a Atx2p de Saccharomyces cerevisiae, uma proteína presente no Golgi e responsável pelo transporte de manganês para o citoplasma da célula. Dados não publicados do nosso grupo demonstram que Zip3 está envolvido na homeostase de manganês e na resposta oxidativa da levedura. Visto que linhagens nulas para ZIP3 apresentam: maior sensibilidade a espécies reativas de oxigênio in vitro; (ii) decréscimo na expressão das duas isoformas de SOD; e (iii) que linhagens nulas para as isoformas de SOD foram consideradas avirulentas em modelo murino; esse trabalho teve como objetivo a avaliação da participação do transportador Zip3 na virulência de C. gattii. Para isso, distintos modelos de fagócitos, como células de macrófagos de murinos ou a ameba Acanthamoeba castellanii, foram expostas à células das linhagens selvagem ou mutante nulo para o gene ZIP3 de C. gattii, sendo avaliada a taxa de fagocitose e o índice de replicação intrafagossômico. Para avaliação da influência do transportador Zip3 na virulência de C. gattii in vivo, realizou-se uma curva de sobrevivência no modelo inseto de Galleria mellonella. Não foi observada diferença na replicação intracelular em nenhum dos modelos testados, no entanto, Zip3 influencia a taxa de fagocitose das leveduras in vitro. Também não houve diferença na letalidade das larvas, sugerindo que o transportador Zip3 não é importante para a virulência de C. gattii nos modelos avaliados.Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis, a fungal disease that affects humans and other animals. This disease is characterized by a primary lung infection that may disseminate systematically and has as primary outcome meningoencephalitis. In this context, alveolar macrophages represent the host's first line of defense and, through phagocytosis, expose yeasts to a hostile environment characterized by acid pH, presence of reactive oxygen and nitrogen species, antimicrobial peptides and nutrient deprivation. In contrast the pathogen expresses high affinity transporters, such as members of the ZIP family, to provide the yeast cell with all the components necessary to develop in this environment. Unpublished data from our group demonstrate that C. gattii ZIP3 product, an ortholog of the Saccharomyces cerevisiae manganese transporter Atx2p, is involved in manganese homeostasis and oxidative metabolism. As the ZIP3 null strains have greater sensitivity to reactive oxygen species in vitro, lower expression of both SOD’s isoforms and that C. gattii SODs null strains were considered avirulent, this work focus on evaluate the participation of Zip3 in the virulence of C. gattii. distinct phagocyte models, such as murine macrophages cells or Acanthamoeba castellanii amoeba, were exposed to the wild-type or null mutant cells for the C. gattii ZIP3 gene, and the rate of phagocytosis and replication index intraphagosomal. To evaluate the influence of the Zip3 transporter on the virulence of C. gattii in vivo, a survival curve was performed on the insect model of Galleria mellonella. No difference was observed in intracellular replication in any of the models tested, however, Zip3 influences the rate of phagocytosis of yeasts in vitro. There was also no difference in lethality of the larvae, suggesting that the Zip3 transporter is not important for the virulence of C. gattii in the evaluated model

Importância do manganês para virulência de Cryptococcus gattii

Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, doença que inicia nos pulmões, com possibilidade de disseminação para o sistema nervoso central e outros órgãos. Os macrófagos alveolares representam a primeira linha de defesa do hospedeiro contra patógenos respiratórios, determinando o desfecho da infecção. Dentre as estratégias utilizadas pelo hospedeiro para se defender contra microrganismos invasores, destaca-se a imunidade nutricional, que consiste no controle da biodisponibilidade de micronutrientes no sítio de infecção. Manganês constitui um alvo interessante de sequestro visto que é essencial para o funcionamento do fungo e progressão da infecção. Embora sistemas que regulam a homeostase de manganês tenham sido bem descritos na levedura modelo Saccharomyces cerevisiae, há pouca informação a respeito de patógenos fúngicos e sua relação com a virulência. No presente trabalho foram caracterizados dois sistemas de importação de manganês na levedura patogênica C. gattii. O gene ZIP3 de C. gattii é um ortólogo direto de ATX2 de S. cerevisiae, que codifica um transportador localizado no complexo de Golgi e é responsável pela extrusão de manganês dessa organela para o citoplasma. A ausência do produto desse gene levou a um aumento da tolerância a manganês, aumento da sensibilidade a espécies reativas de oxigênio e alteração da expressão de sistemas redox na célula. Ademais, células ausentes em Zip3 apresentaram redução na virulência em modelo não mamífero de infecção, corroborando com alterações em determinantes de virulência clássicos nessa levedura, como deposição do pigmento melanina, secreção do polissacarídeo glicuronoxilomanana e perfil alterado de secreção de vesículas extracelulares. O principal sistema de aquisição de manganês em fungos, no entanto, é constituído por transportadores da família Nramp. C. gattii apresenta apenas um membro dessa família de proteínas e é predito que se localize na membrana celular. A ausência desse transportador levou a um aumento da sensibilidade a agentes quelantes e a espécies reativas de oxigênio. Além disso, linhagens mutantes nulas para esse gene apresentaram redução da virulência em um modelo não mamífero de infecção. Sendo assim, nossos resultados demonstram a importância da manutenção da homeostase de manganês na levedura patogênica C. gattii e sua correlação com a virulência desse patógeno.Cryptococcus gattii is one of the etiological agents of cryptococcosis, a disease that primarily affects the lungs and can spread to the central nervous system and other organs. Alveolar macrophages represent the host’s first line of defense against respiratory pathogens, determining the outcome of the infection. Among the strategies utilized by the host to defend against invading microorganisms, nutritional immunity stands out, which consists of controlling the bioavailability of micronutrients at the site of infection. Manganese is an interesting sequestration target as it is essential for proper fungus function and infection progression. Although systems that regulate manganese homeostasis have been well studied in the model yeast Saccharomyces cerevisiae, little information is available regarding fungal pathogens and its association with virulence. In the present work, two manganese import systems in the pathogenic yeast C. gattii were functionally characterized. The C. gattii ZIP3 gene is a direct ortholog of ATX2 from S. cerevisiae, which encodes a transporter located to the Golgi apparatus and is responsible for the extrusion of manganese from this organelle into the cytoplasm. The absence of this gene product led to an increase in manganese tolerance, increased sensitivity to reactive oxygen species and alteration in expression of redox systems in the cell. Furthermore, cells lacking Zip3 presented a decrease in virulence in a non-mammalian model of infection, corroborating changes in classic virulence determinants in this yeast, such as melanin deposition, secretion of the polysaccharide glucuronoxylomannan and altered profile of extracellular vesicle secretion. The main manganese acquisition system in fungi, however, is constituted by transporters of the Nramp family. C. gattii has only one member of this protein family and is predicted to locate in the cell membrane. The absence of this transporter led to increased sensitivity to chelating agents and reactive oxygen species. Furthermore, null mutant strains for this gene presented reduced virulence in a non-mammalian model of infection. Therefore, our results demonstrate the importance of proper manganese homeostasis in the pathogenic yeast C. gattii and its correlation with virulence in this pathogen

Transcriptomic analysis reveals that mTOR pathway can be modulated in macrophage cells by the presence of cryptococcal cells

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiological agents of cryptococcosis, a high mortality disease. The development of such disease depends on the interaction of fungal cells with macrophages, in which they can reside and replicate. In order to dissect the molecular mechanisms by which cryptococcal cells modulate the activity of macrophages, a genome-scale comparative analysis of transcriptional changes in macrophages exposed to Cryptococcus spp. was conducted. Altered expression of nearly 40 genes was detected in macrophages exposed to cryptococcal cells. The major processes were associated with the mTOR pathway, whose associated genes exhibited decreased expression in macrophages incubated with cryptococcal cells. Phosphorylation of p70S6K and GSK-3β was also decreased in macrophages incubated with fungal cells. In this way, Cryptococci presence could drive the modulation of mTOR pathway in macrophages possibly to increase the survival of the pathogen

Análise da participação do transportador ZIP3 na virulência de Cryptococcus gattii

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, doença fúngica que afeta humanos e outros animais. Essa patologia é caracterizada por uma infecção pulmonar primária, com possível disseminação sistêmica posterior e resultando no quadro potencialmente letal de meningoencefalite. Nesse contexto, macrófagos alveolares representam a primeira linha de defesa do hospedeiro e, por meio da fagocitose, expõem as leveduras a um ambiente hostil caracterizado por um pH ácido, presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, peptídeos antimicrobianos e privação de nutrientes. Em contrapartida o patógeno expressa transportadores de alta afinidade, como os membros da família ZIP, para prover a célula da levedura com todos os componentes necessários para se desenvolver neste ambiente. O transportador codificado pelo gene ZIP3 de C. gattii é ortólogo a Atx2p de Saccharomyces cerevisiae, uma proteína presente no Golgi e responsável pelo transporte de manganês para o citoplasma da célula. Dados não publicados do nosso grupo demonstram que Zip3 está envolvido na homeostase de manganês e na resposta oxidativa da levedura. Visto que linhagens nulas para ZIP3 apresentam: maior sensibilidade a espécies reativas de oxigênio in vitro; (ii) decréscimo na expressão das duas isoformas de SOD; e (iii) que linhagens nulas para as isoformas de SOD foram consideradas avirulentas em modelo murino; esse trabalho teve como objetivo a avaliação da participação do transportador Zip3 na virulência de C. gattii. Para isso, distintos modelos de fagócitos, como células de macrófagos de murinos ou a ameba Acanthamoeba castellanii, foram expostas à células das linhagens selvagem ou mutante nulo para o gene ZIP3 de C. gattii, sendo avaliada a taxa de fagocitose e o índice de replicação intrafagossômico. Para avaliação da influência do transportador Zip3 na virulência de C. gattii in vivo, realizou-se uma curva de sobrevivência no modelo inseto de Galleria mellonella. Não foi observada diferença na replicação intracelular em nenhum dos modelos testados, no entanto, Zip3 influencia a taxa de fagocitose das leveduras in vitro. Também não houve diferença na letalidade das larvas, sugerindo que o transportador Zip3 não é importante para a virulência de C. gattii nos modelos avaliados.Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis, a fungal disease that affects humans and other animals. This disease is characterized by a primary lung infection that may disseminate systematically and has as primary outcome meningoencephalitis. In this context, alveolar macrophages represent the host's first line of defense and, through phagocytosis, expose yeasts to a hostile environment characterized by acid pH, presence of reactive oxygen and nitrogen species, antimicrobial peptides and nutrient deprivation. In contrast the pathogen expresses high affinity transporters, such as members of the ZIP family, to provide the yeast cell with all the components necessary to develop in this environment. Unpublished data from our group demonstrate that C. gattii ZIP3 product, an ortholog of the Saccharomyces cerevisiae manganese transporter Atx2p, is involved in manganese homeostasis and oxidative metabolism. As the ZIP3 null strains have greater sensitivity to reactive oxygen species in vitro, lower expression of both SOD’s isoforms and that C. gattii SODs null strains were considered avirulent, this work focus on evaluate the participation of Zip3 in the virulence of C. gattii. distinct phagocyte models, such as murine macrophages cells or Acanthamoeba castellanii amoeba, were exposed to the wild-type or null mutant cells for the C. gattii ZIP3 gene, and the rate of phagocytosis and replication index intraphagosomal. To evaluate the influence of the Zip3 transporter on the virulence of C. gattii in vivo, a survival curve was performed on the insect model of Galleria mellonella. No difference was observed in intracellular replication in any of the models tested, however, Zip3 influences the rate of phagocytosis of yeasts in vitro. There was also no difference in lethality of the larvae, suggesting that the Zip3 transporter is not important for the virulence of C. gattii in the evaluated model