Funktionale Charakterisierung einer Gruppe Adenylat bildender Enzyme aus Arabidopsis thaliana: Die Rolle 4CL-ähnlicher Enzyme im Metabolismus von Fettsäuren und Phytohormonen

Adenylat bildende Enzyme nehmen eine zentrale Funktion in vielen Stoffwechselwegen ein. Sie katalysieren die Reaktion von Carbonsäuren mit ATP zu einem AMP-Anhydrid (dem Adenylat) und den darauf folgenden Transfer an einen Acyl-Endakzeptor, oftmals Coenzym A. In dieser Arbeit wurde eine Gruppe von Proteinen analysiert, die auf Grund ihrer Sequenz- und Strukturähnlichkeiten zu den 4-Cumarat:CoA-Ligasen (4CL) als putative Adenylat bildende Enzyme identifiziert, aber größtenteils noch nicht charakterisiert wurden. Diese Proteine werden als 4CL-ähnliche Proteine (4CLL) bezeichnet. Zur Charakterisierung der 4CLLs wurden diese zunächst heterolog exprimiert, aufgereinigt und einem umfangreichen Substratscreen mit rund 100 Carbonsäuren aus verschiedenen strukturellen Klassen unterzogen. Dabei zeigte sich, dass die Mehrheit der untersuchten 4CLLs als Acyl-CoA-Synthetasen von Fettsäuren verschiedenster Kettenlängen und Sättigungsgrade fungiert. Dies konnte durch einen in vivo-Assay bestätigt werden, welcher auf der Komplementation eines Acyl-CoA-Synthetase-defizienten E. coli-Stammes basiert. Somit aktivieren sechs der neun überprüften 4CLLs Fettsäuren und bilden damit, neben den bereits bekannten Acyl-CoA-Synthetasen langkettiger Fettsäuren (LACS), eine weitere Gruppe von Acyl-CoA-Synthetasen in A. thaliana. Zusätzlich aktivieren einige 4CLLs Derivate und Vorstufen der Phytohormone Jasmonsäure (JA) und Indolessigsäure (IAA). Das Enzym At1g20510 konnte als OPC-8:CoA-Ligase identifiziert werden. Es aktiviert eine Zwischenstufe der JA-Biosynthese, OPC-8, zum korrespondierenden CoA-Ester. Diese Funktion konnte in vivo durch Analysen von Verlustmutanten des entsprechenden Gens, die reduzierte Mengen an JA aufwiesen, bestätigt werden. Mit At4g05160 und At5g63380 konnten erstmals Enzyme beschrieben werden, die das IAA-Derivat Indolbuttersäure (IBA) in den korrespondierenden CoA-Ester überführen. Neben der unter in vitro-Bedingungen geringen, aber signifikanten IBA:CoA-Ligase-Aktivität zeigte die Analyse von Doppelmutanten beider Gene deutlich veränderte IAA- und IBA-Mengen. Des Weiteren konnte At1g62940 als Acyl-CoA-Synthetase von Hydroxyfettsäuren identifiziert werden und ist vermutlich an der Biosynthese von Sporopollenin in Blütenknospen beteiligt. Die funktionale Analyse der 4CLLs wurde jeweils durch Untersuchungen zur Expression der korrespondierenden Gene ergänzt. Insgesamt ergibt sich damit ein umfassendes Bild einer Gruppe von CoA-Ligasen, deren Vertreter differenzierte, wichtige Funktionen im Stoffwechsel von A. thaliana übernehmen