Die Rolle der Proteinkinase RIP1 bei Infektionen durch das humane Cytomegalievirus

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der zellulären Serin/Threonin-Kinase RIP1 für die HCMV-Infektion verifiziert. Die bereits in der Literatur beschriebene Hochregulation der Expression von RIP1 während der HCMV-Infektion, konnte auch in HFF-Zellen gezeigt werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Kinase-Aktivität von RIP1 für die HCMV-Replikation in HFF-Zellen notwendig war, da die Überexpression der Kinase-inaktiven RIP1-Mutante RIP K45R in HCMV-Replikations-Tests die Virusproduktion hemmen konnte. Weitere HCMV-Replikations-Tests mit RIP-Konstrukten zeigten, dass nicht alleine die Kinase-Aktivität von RIP1, und die damit verbundene Phosphorylierung möglicher viraler oder zellulärer Substrate, sondern wahrscheinlich auch die Bindung dieser Substrate an die Intermediär- und/oder die Deathdomäne, wichtig für die HCMV-Replikation war. Allerdings schien RIP1 nur zelltypspezifisch in HFF-Zellen notwendig für die HCMV-Replikation zu sein. Die Bedeutung von RIP1 für die HCMV-Infektion konnte nicht nur genetisch durch den Einsatz einer Kinase-inaktiven RIP1-Mutante, sondern auch chemisch mit Hilfe von RIP1-Kinase-Inhibitoren validiert werden. Interaktionen mit HCMV-viralen Proteinen, Effekte auf physiologische Zellfunktionen oder auf die Aktivierung von zellulären Signalwegen (z.B. MAP Kinase- und NFB-Signalwege) konnten als Ursachen für die Hemmung der HCMV-Replikation durch die Expression von RIP K45R weitgehend ausgeschlossen werden. Anhand von Sekretions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass Überstände der mit RIP K45R transduzierten Zellen die HCMV-Replikation um ca. 50% hemmen konnten. In „cDNA-Arrays“, PCR-Analysen und Zytokin-ELISA-Tests konnten vor allen Dingen antivirale Zytokine wie z.B. MIP-1, RANTES, Eotaxin, IL-6 und IL-8 identifiziert werden, deren Transkription und Sekretion durch RIP1 gehemmt wurde. Von den identifizierten Zytokinen konnten IL-8 und RANTES die HCMV-Replikation per se supprimieren. Am Modell des IL-8-Promotors konnte gezeigt werden, dass die Expression und Sekretion der Zytokine IL-8 und RANTES möglicherweise über die Interaktion der RIP1-Kinase- und Intermediärdomäne mit ihren Promotoren gehemmt werden könnte. Als These wurde diskutiert, dass die Expression der Kinase-inaktiven RIP-Mutante RIP K45R wahrscheinlich über einen „dominant-negativen“ Effekt auf endogenes RIP1 über einen bislang nicht geklärten Signalweg die Expression antiviraler Zytokine „aktivieren“ und so die HCMV-Replikation hemmen konnte. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten deuteten darauf hin, dass die Hochregulation von RIP1 während der HCMV-Infektion, die antivirale Immunantwort hemmt. Dieses Ergebnis macht die zelluläre RIP1-Kinase zu einem Kandidaten für die Entwicklung spezifischer Inhibitoren, die den Vorteil hätten, dass sie nicht zur Resistenzbildung beitrage

Die Rolle der Proteinkinase RIP1 bei Infektionen durch das humane Cytomegalievirus

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der zellulären Serin/Threonin-Kinase RIP1 für die HCMV-Infektion verifiziert. Die bereits in der Literatur beschriebene Hochregulation der Expression von RIP1 während der HCMV-Infektion, konnte auch in HFF-Zellen gezeigt werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Kinase-Aktivität von RIP1 für die HCMV-Replikation in HFF-Zellen notwendig war, da die Überexpression der Kinase-inaktiven RIP1-Mutante RIP K45R in HCMV-Replikations-Tests die Virusproduktion hemmen konnte. Weitere HCMV-Replikations-Tests mit RIP-Konstrukten zeigten, dass nicht alleine die Kinase-Aktivität von RIP1, und die damit verbundene Phosphorylierung möglicher viraler oder zellulärer Substrate, sondern wahrscheinlich auch die Bindung dieser Substrate an die Intermediär- und/oder die Deathdomäne, wichtig für die HCMV-Replikation war. Allerdings schien RIP1 nur zelltypspezifisch in HFF-Zellen notwendig für die HCMV-Replikation zu sein. Die Bedeutung von RIP1 für die HCMV-Infektion konnte nicht nur genetisch durch den Einsatz einer Kinase-inaktiven RIP1-Mutante, sondern auch chemisch mit Hilfe von RIP1-Kinase-Inhibitoren validiert werden. Interaktionen mit HCMV-viralen Proteinen, Effekte auf physiologische Zellfunktionen oder auf die Aktivierung von zellulären Signalwegen (z.B. MAP Kinase- und NFB-Signalwege) konnten als Ursachen für die Hemmung der HCMV-Replikation durch die Expression von RIP K45R weitgehend ausgeschlossen werden. Anhand von Sekretions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass Überstände der mit RIP K45R transduzierten Zellen die HCMV-Replikation um ca. 50% hemmen konnten. In „cDNA-Arrays“, PCR-Analysen und Zytokin-ELISA-Tests konnten vor allen Dingen antivirale Zytokine wie z.B. MIP-1, RANTES, Eotaxin, IL-6 und IL-8 identifiziert werden, deren Transkription und Sekretion durch RIP1 gehemmt wurde. Von den identifizierten Zytokinen konnten IL-8 und RANTES die HCMV-Replikation per se supprimieren. Am Modell des IL-8-Promotors konnte gezeigt werden, dass die Expression und Sekretion der Zytokine IL-8 und RANTES möglicherweise über die Interaktion der RIP1-Kinase- und Intermediärdomäne mit ihren Promotoren gehemmt werden könnte. Als These wurde diskutiert, dass die Expression der Kinase-inaktiven RIP-Mutante RIP K45R wahrscheinlich über einen „dominant-negativen“ Effekt auf endogenes RIP1 über einen bislang nicht geklärten Signalweg die Expression antiviraler Zytokine „aktivieren“ und so die HCMV-Replikation hemmen konnte. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten deuteten darauf hin, dass die Hochregulation von RIP1 während der HCMV-Infektion, die antivirale Immunantwort hemmt. Dieses Ergebnis macht die zelluläre RIP1-Kinase zu einem Kandidaten für die Entwicklung spezifischer Inhibitoren, die den Vorteil hätten, dass sie nicht zur Resistenzbildung beitrage