Activation fibroblastique et nouvelles approches thérapeutiques dans la Sclérodermie systémique

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le déclenchement et le développement de la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons mis au point un modèle murin où la maladie est déclenchée par divers types de stress oxydant, puis nous avons exploré les différentes voies d'activation des fibroblastes sous l'effet des formes réactives de l'oxygène, afin de déterminer d'éventuelles cibles thérapeutiques. Pour apprécier les effets d un stress oxydant chronique, des solutions contenant différents oxydants ont été injectées dans la peau de souris BALB/c et BALB/c SCID. Les solutions contenant le radical hydroxyl OH ou HOCl ont induit une maladie caractérisée, comme la ScS diffuse, par une fibrose cutanée et viscérale, et des auto-anticorps anti-ADN topoisomérase-1. Les sérums de ces souris contenaient de grandes quantités de dérivés oxydés des protéines et induisaient la prolifération des fibroblastes et la production de formes réactives de l oxygène par les cellules endothéliales. Une fibrose pulmonaire de moindre importance était induite chez les souris BALB/c SCID. Grâce à ce nouveau modèle murin de SSc, nous avons démontré que le stress oxydant était directement responsable des anomalies observées dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et le système immunitaire. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour analyser les voies d activation fibroblastique dans la ScS. Dans les fibroblastes des souris exposées à HOCl, on observe une dérégulation des voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes, et des récepteurs au PDGF. On observe les mêmes dérégulations ex vivo dans les fibroblastes de patients atteints de SSc diffuse. Nous avons ainsi observé une amélioration clinique significative chez les souris sclérodermiques traitées avec un inhibiteur de l activation de Notch, avec un agoniste des récepteurs aux cannabinoïdes, et avec des inhibiteurs de tyrosine-kinase ciblant le récepteur au PDGF. Puisque les fibroblastes sclérodermiques ont un phénotype activé et produisent de forts taux de formes réactives de l oxygène, nous avons enfin mis à profit cette particularité pour induire l apoptose sélective de ces cellules dans le derme des souris. Le trioxyde d arsenic, molécule cytotoxique utilisée en thérapeutique humaine, augmente la production cellulaire de formes réactives de l oxygène au-delà d un seuil létal et induit ainsi l apoptose des fibroblastes sclérodermiques. L utilisation in vivo de cette molécule dans notre modèle murin prévient la fibrose cutanée et viscérale, et les anomalies endothéliales. Le trioxyde d arsenic a un effet comparable dans le modèle murin de ScS associée à la réaction du greffon contre l hôte en détruisant les lymphocytes T CD4+ alloréactifs activés et les cellules dendritiques plasmacytoïdes responsables de l activation du système immunitaire. Les formes réactives de l oxygène sont donc impliquées dans l induction des lésions observées au cours de la ScS. Dans notre modèle, le rôle du système immunitaire intervient dans l'auto-entretien et l extension systémique de la maladie. Le stress oxydant contribue à la dérégulation de diverses voies de signalisation dont les voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes et du PDGF dans les fibroblastes. La modulation de ces voies permet d obtenir une amélioration clinique chez les souris sclérodermiques, tout comme l utilisation du trioxyde d arsenic qui entraîne la délétion spécifique des fibroblastes sclérodermiques surpoduisant des formes réactives de l oxygène. Le trioxyde d arsenic montre également une efficacité intéressante dans le modèle de sclérodermie associée à la maladie du greffon contre l hôte via la délétion des lymphocytes T CD4+ alloréactifs.We defend the thesis that the oxidative stress plays a major role in the initiation and the development of systemic sclerosis. To demonstrate this thesis, we designed an original mouse model: BALB/c and BALB/SCID mice were injected intra-dermally with prooxidative agents, bleomycin or PBS for 6 weeks. Hypochlorite and hydroxyl radicals induced cutaneous and lung fibrosis in BALB/c mice, in association with anti-DNA topoisomerase-1 auto-antibodies that characterize human diffuse systemic sclerosis. Pulmonary fibrosis was less extensive in BALB/c SCID mice submitted to the same protocol. In this model of HOCl-induced systemic sclerosis, cutaneous fibroblasts display a hyperactivated phenotype that prompted us to investigate several pathways of cellular activation. The NOTCH pathway and the PGDF-receptor pathways were found upregulated in the skin of HOCl-mice. DAPT (a gamma secretase inhibitor that prevents NOTCH cleavage), Sunitinib (an inhibitor of PGDF-receptor phosphorylation), and WIN-55,212, an agonist of the cannabinoid receptors 1 and 2, dramatically improved the clinical, histological and biological signs of systemic sclerosis in the HOCl model.In our model as in patients with SSc, activated fibroblasts produce reactive oxygen species that exert an autocrine effect on their own proliferation and collagen synthesis. By analogy with tumor cells that undergo apoptosis upon cytotoxic treatment that triggers an oxidative stress beyond a lethal threshold, we showed that activated fibroblasts can be selectively killed by the cytotoxic molecule arsenic trioxide (As2O3) that generates intracellular ROS. In the mouse model of sclerodermatous-graft versus host disease (Scl-GVHD), daily intra-peritoneal injections of As2O3 abrogated the clinical symptoms (diarrhea, alopecia, vasculitis, fibrosis of the skin and visceral organs) and specifically induced the apoptosis of activated CD4+ T cells and plasmacytoid dendritic cells. Those data provide a rationale for the evaluation of As2O3 in the management of patients affected by systemic sclerosis or chronic GVHD.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

The Nrf2-Antioxidant Response Element Signaling Pathway Controls Fibrosis and Autoimmunity in Scleroderma

Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease with fibrosis of the skin and internal organs and vascular alterations. Dysregulations in the oxidant/antioxidant balance are known to be a major factor in the pathogenesis of the disease. Indeed, reactive oxygen species (ROS) trigger neoepitopes leading to a breach of immune tolerance and autoimmune responses, activate fibroblasts to proliferate and to produce excess of type I collagen. ROS also alter endothelial cells leading to vascular dysfunction. Glutathione (GSH) is the most potent antioxidant system in eukaryotic cells. Numerous studies have reported a defect in GSH in SSc animal models and humans, but the origin of this defect remains unknown. The transcription factor NRF2 is a key player in the antioxidant defense, as it can induce the transcription of antioxidant and cytoprotective genes, including GSH, through its interaction with the antioxidant response elements. In this work, we investigated whether NRF2 could be implicated in the pathogenesis of SSc, and if this pathway could represent a new therapeutic target in this orphan disease with no curative medicine. Skin biopsies from 11 patients and 10 controls were harvested, and skin fibroblasts were extracted. Experimental SSc was induced both in BALB/c and in nrf2−/− mice by daily intradermal injections of hypochloric acid. In addition, diseased BALB/c mice were treated with an nrf2 agonist, dimethyl fumarate, or placebo. A drop in nrf2 and target genes mRNA levels was observed in skin fibroblasts of SSc patients compared to controls. Moreover, the nrf2 pathway is also downregulated in skins and lungs of SSc mice. In addition, we observed that nrf2−/− mice have a more severe form of SSc with increased fibrosis and inflammation compared to wild-type SSc mice. Diseased mice treated with the nrf2 agonist dimethyl fumarate (DMF) exhibited reduced fibrosis and immune activation compared to untreated mice. The ex vivo treatment of skin fibroblasts from SSc mice with DMF restores GSH intracellular content, decreases ROS production and cell proliferation. These results suggest that the nrf2 pathway is highly dysregulated in human and SSc mice with deleterious consequences on fibrosis and inflammation and that Nrf2 modulation represents a therapeutic target in SSc

Characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein reveals multiple functional consequences of the C-terminal domain

Nucleocapsid (N) encoded by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) plays key roles in the replication cycle and is a critical serological marker. Here, we characterize essential biochemical properties of N and describe the utility of these insights in serological studies. We define N domains important for oligomerization and RNA binding and show that N oligomerization provides a high-affinity RNA-binding platform. We also map the RNA-binding interface, showing protection in the N-terminal domain and linker region. In addition, phosphorylation causes reduction of RNA binding and redistribution of N from liquid droplets to loose coils, showing how N-RNA accessibility and assembly may be regulated by phosphorylation. Finally, we find that the C-terminal domain of N is the most immunogenic, based on antibody binding to patient samples. Together, we provide a biochemical description of SARS-CoV-2 N and highlight the value of using N domains as highly specific and sensitive diagnostic markers

Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Mangafodipir is a contrast agent used in magnetic resonance imaging that concentrates in the liver and displays pleiotropic antioxidant properties. Since reactive oxygen species are involved in ischemia-reperfusion damages, we hypothesized that the use of mangafodipir could prevent liver lesions in a mouse model of hepatic ischemia reperfusion injury. Mangafodipir (MnDPDP) was compared to ischemic preconditioning and intermittent inflow occlusion for the prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury in the mouse.Mice were subjected to 70% hepatic ischemia (continuous ischemia) for 90 min. Thirty minutes before the ischemic period, either mangafodipir (10 mg/kg) or saline was injected intraperitoneally. Those experimental groups were compared with one group of mice preconditioned by 10 minutes' ischemia followed by 15 minutes' reperfusion, and one group with intermittent inflow occlusion. Hepatic ischemia-reperfusion injury was evaluated by measurement of serum levels of aspartate aminotransferase (ASAT) activity, histologic analysis of the livers, and determination of hepatocyte apoptosis (cytochrome c release, caspase 3 activity). The effect of mangafodipir on the survival rate of mice was studied in a model of total hepatic ischemia.<0.01), and by higher rates of survival in treated than in untreated animals (P<0.001). The level of protection by mangafodipir was similar to that observed following intermittent inflow occlusion and higher than after ischemic preconditioning.Mangafodipir is a potential new preventive treatment for hepatic ischemia-reperfusion injury

Fibroblast activation and new therapeutic approaches in systemic sclerosis

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le déclenchement et le développement de la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons mis au point un modèle murin où la maladie est déclenchée par divers types de stress oxydant, puis nous avons exploré les différentes voies d'activation des fibroblastes sous l'effet des formes réactives de l'oxygène, afin de déterminer d'éventuelles cibles thérapeutiques. Pour apprécier les effets d’un stress oxydant chronique, des solutions contenant différents oxydants ont été injectées dans la peau de souris BALB/c et BALB/c SCID. Les solutions contenant le radical hydroxyl OH° ou HOCl ont induit une maladie caractérisée, comme la ScS diffuse, par une fibrose cutanée et viscérale, et des auto-anticorps anti-ADN topoisomérase-1. Les sérums de ces souris contenaient de grandes quantités de dérivés oxydés des protéines et induisaient la prolifération des fibroblastes et la production de formes réactives de l’oxygène par les cellules endothéliales. Une fibrose pulmonaire de moindre importance était induite chez les souris BALB/c SCID. Grâce à ce nouveau modèle murin de SSc, nous avons démontré que le stress oxydant était directement responsable des anomalies observées dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et le système immunitaire. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour analyser les voies d’activation fibroblastique dans la ScS. Dans les fibroblastes des souris exposées à HOCl, on observe une dérégulation des voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes, et des récepteurs au PDGF. On observe les mêmes dérégulations ex vivo dans les fibroblastes de patients atteints de SSc diffuse. Nous avons ainsi observé une amélioration clinique significative chez les souris sclérodermiques traitées avec un inhibiteur de l’activation de Notch, avec un agoniste des récepteurs aux cannabinoïdes, et avec des inhibiteurs de tyrosine-kinase ciblant le récepteur au PDGF. Puisque les fibroblastes sclérodermiques ont un phénotype activé et produisent de forts taux de formes réactives de l’oxygène, nous avons enfin mis à profit cette particularité pour induire l’apoptose sélective de ces cellules dans le derme des souris. Le trioxyde d’arsenic, molécule cytotoxique utilisée en thérapeutique humaine, augmente la production cellulaire de formes réactives de l’oxygène au-delà d’un seuil létal et induit ainsi l’apoptose des fibroblastes sclérodermiques. L’utilisation in vivo de cette molécule dans notre modèle murin prévient la fibrose cutanée et viscérale, et les anomalies endothéliales. Le trioxyde d’arsenic a un effet comparable dans le modèle murin de ScS associée à la réaction du greffon contre l’hôte en détruisant les lymphocytes T CD4+ alloréactifs activés et les cellules dendritiques plasmacytoïdes responsables de l’activation du système immunitaire. Les formes réactives de l’oxygène sont donc impliquées dans l’induction des lésions observées au cours de la ScS. Dans notre modèle, le rôle du système immunitaire intervient dans l'auto-entretien et l’extension systémique de la maladie. Le stress oxydant contribue à la dérégulation de diverses voies de signalisation dont les voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes et du PDGF dans les fibroblastes. La modulation de ces voies permet d’obtenir une amélioration clinique chez les souris sclérodermiques, tout comme l’utilisation du trioxyde d’arsenic qui entraîne la délétion spécifique des fibroblastes sclérodermiques surpoduisant des formes réactives de l’oxygène. Le trioxyde d’arsenic montre également une efficacité intéressante dans le modèle de sclérodermie associée à la maladie du greffon contre l’hôte via la délétion des lymphocytes T CD4+ alloréactifs.We defend the thesis that the oxidative stress plays a major role in the initiation and the development of systemic sclerosis. To demonstrate this thesis, we designed an original mouse model: BALB/c and BALB/SCID mice were injected intra-dermally with prooxidative agents, bleomycin or PBS for 6 weeks. Hypochlorite and hydroxyl radicals induced cutaneous and lung fibrosis in BALB/c mice, in association with anti-DNA topoisomerase-1 auto-antibodies that characterize human diffuse systemic sclerosis. Pulmonary fibrosis was less extensive in BALB/c SCID mice submitted to the same protocol. In this model of HOCl-induced systemic sclerosis, cutaneous fibroblasts display a hyperactivated phenotype that prompted us to investigate several pathways of cellular activation. The NOTCH pathway and the PGDF-receptor pathways were found upregulated in the skin of HOCl-mice. DAPT (a gamma secretase inhibitor that prevents NOTCH cleavage), Sunitinib (an inhibitor of PGDF-receptor phosphorylation), and WIN-55,212, an agonist of the cannabinoid receptors 1 and 2, dramatically improved the clinical, histological and biological signs of systemic sclerosis in the HOCl model.In our model as in patients with SSc, activated fibroblasts produce reactive oxygen species that exert an autocrine effect on their own proliferation and collagen synthesis. By analogy with tumor cells that undergo apoptosis upon cytotoxic treatment that triggers an oxidative stress beyond a lethal threshold, we showed that activated fibroblasts can be selectively killed by the cytotoxic molecule arsenic trioxide (As2O3) that generates intracellular ROS. In the mouse model of sclerodermatous-graft versus host disease (Scl-GVHD), daily intra-peritoneal injections of As2O3 abrogated the clinical symptoms (diarrhea, alopecia, vasculitis, fibrosis of the skin and visceral organs) and specifically induced the apoptosis of activated CD4+ T cells and plasmacytoid dendritic cells. Those data provide a rationale for the evaluation of As2O3 in the management of patients affected by systemic sclerosis or chronic GVHD

Implication de la voie Notch dans la sclérodermie systémique

PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Impact of MPO-ANCA-mediated oxidative imbalance on renal vasculitis

International audienceGlomerulonephritis is a severe complication of microscopic polyangiitis (MPA), a small-vessel vasculitis associated with anti-myeloperoxidase antibodies (MPO-ANCA). We previously showed the pathogenic effects of MPO-ANCA that activate MPO to trigger an oxidative burst mainly through HOCl production, contributing to endothelial injury and lung fibrosis. The aim of this study was to investigate the relationship between MPO-induced oxidative stress, anti-oxidant defenses and renal histological lesions in MPA patients. We therefore analyzed histological data from a prospective cohort of ANCA-associated glomerulonephritis. Serum-mediated HOCl production, advanced oxidation protein products (AOPP), and thiol concentration in sera were determined. From 38 patients included, histological classification noted 50% focal glomerulonephritis, 15.8% crescentic-glomerulonephritis, and 34.2% mixed-glomerulonephritis. MPA patients' sera displayed higher HOCl production by MPO ( P \textless 0.001), higher AOPP ( P \textless 0.001) and thiol ( P \textless 0.01) levels, compared with healthy subjects. The presence of cellular crescents was associated with higher serum-mediated HOCl production ( P = 0.049) and lower thiol levels ( P = 0.022) at disease onset. Higher thiol concentrations were associated with focal glomerulonephritis ( P = 0.042), less interstitial fibrosis ( P = 0.039) and hyalinosis ( P = 0.066). In remission, HOCl production was decreased ( P \textless 0.01), and thiol concentration remained high ( P = 0.39). Our findings suggest that HOCl production by activated MPO could contribute to the very early stage of glomerulonephritis, whereas thiol may exert a protective effect against the development of renal vasculitis and glomerulosclerosis. This study highlights the importance of oxidative defenses to counteract the process of MPO-ANCA associated glomerulonephritis