Hoitovastetta ennustavat biomarkkerit diffuuseissa glioomissa ja ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä

The presence of certain cancer-related genetic and epigenetic alterations in the tumor affect patients´ response to specific cancer therapies. The accurate screening of these predictive biomarkers in molecular diagnostics is important since it enables the tailoring of an optimal treatment based on molecular characteristics of the tumor. Depending on the type of gene alteration, a wide variety of methods could be applied in biomarker testing. Among the novel methods is next-generation sequencing (NGS) technology, enabling simultaneous detection of multiple alterations. The aim of this thesis was to analyze predictive or potentially predictive genetic and epigenetic alterations of diffuse gliomas and non-small cell lung cancer (NSCLC), and to evaluate the feasibility of pyrosequencing and targeted NGS in the detection of these alterations in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue specimens. In Study I, we assessed the genetic and epigenetic profile of diffuse gliomas by applying methylation-specific pyrosequencing to detect MGMT promoter hypermethylation, array comparative genomic hybridization to detect chromosomal copy number alterations, and immunohistochemistry (IHC) to detect IDH1 mutation status. MGMT hypermethylation, IDH1 mutations, and losses of chromosome arms 1p and 19q were typical changes in oligodendroglial tumors (grades II-III), whereas losses of 9p and 10q were frequently seen in glioblastomas (grade IV). Furthermore, we detected significant associations of 1) MGMT hypermethylation with IDH1 mutations and loss of 19q, 2) unmethylated MGMT with losses of 9p and 10q and gain of 7p, 3) IDH1 mutations with MGMT hypermethylation, 1p loss, and combined loss of 1p/19q, and 4) non-mutated IDH1 with losses of 10q. Pyrosequencing proved to be a feasible method for determination of MGMT methylation status in FFPE sample material. In Studies II and III, we compared targeted NGS with fluorescence in situ hybridization, IHC, and real-time reverse-transcription PCR in the detection of ALK fusion (Study II), and with real-time PCR in the detection of EGFR, KRAS, and BRAF mutations (Study III). All analyses were successfully performed on all FFPE samples. A good concordance was observed between the results obtained by different methods, and targeted NGS also proved to be advantageous in the identification of novel and rare variants with a potential predictive value. In Study IV, we determined the frequency of ALK fusion in 469 Finnish NSCLC patients, and the association of ALK fusion with clinicopathological characteristics and with the presence of mutations in 22 other driver genes. We detected ALK fusion at a frequency of 2.3%, suggesting that it is a relatively rare alteration in Finnish NSCLC patients. The presence of ALK fusion was significantly linked to younger age and never-/ex-light smoking history. Although most of the ALK-positive tumors had adenocarcinoma histology, also ALK-positive large cell carcinomas were detected. Characterization of ALK-positive cases by targeted NGS showed a coexistence of ALK fusion with mutations in MET, TP53, CTNNB1, and PIK3CA, but the value of these co-occurrences requires further examination. In conclusion, our studies indicate that certain genetic and epigenetic alterations occur together, and the simultaneous screening of multiple alterations may thus allow one to obtain a more comprehensive picture of the molecular background of the tumor, which could facilitate prediction of tumor behavior, prognosis, and treatment response. Our results show the feasibility of pyrosequencing and targeted NGS in FFPE tumor tissue material and also the advantages of targeted NGS over other commonly used methods in the detection of gene rearrangements and mutations, particularly the ability to simultaneously identify multiple alterations.Tiettyjen syöpään liityvien geneettisten ja epigeneettisten muutosten esiintyminen kasvaimissa vaikuttaa potilaan vasteeseen syöpähoidoille. Näiden hoitovastetta ennustavien, prediktiviisten biomarkkereiden tarkka seulonta molekyylidiagnostiikassa on tärkeää, sillä se mahdollistaa optimaalisen hoidon räätälöinnin kasvaimen molekulaaristen ominaisuuksien perusteella. Geenimuutoksesta riippuen biomarkkereiden testauksessa voidaan hyödyntää useita eri menetelmiä, joista uusimpien joukossa ovat lukuisten markkereiden samanaikaisen tutkimisen mahdollistavat uuden sukupolven sekvensointimenetelmät. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli analysoida hoitovastetta ennustavia geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia glioomissa ja ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä. Lisäksi työssä arvioitiin pyrosekvensoinnin ja kohdennetun uuden sukupolven sekvensoinnin soveltuvuutta näiden muutosten tunnistamiseen formaliiniin fiksoiduista ja parafiiniin valetuista (FFPE) kasvainkudosnäytteistä. Ensimmäisessä osatyössä tutkimme 51 glioomanäytettä määrittämällä niistä MGMT-geenin säätelyalueen metyloitumisasteen pyrosekvensoinnilla, kromosomien kopiolukumäärämuutokset mikrosirupohjaisella vertailevalla genomisella hybridisaatiolla ja IDH1-geenin mutaatiostatuksen immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tutkimuksessa havaitsimme vaihtelua tutkittujen biomarkkerien esiintymisessä eri glioomatyyppien välillä; MGMT-geenin metylaatio, IDH1-geenin mutaatiot sekä kromosomien 1p ja 19q puutokset olivat tyypillisiä muutoksia oligodendrogliaalisissa kasvaimissa (gradus II-III), kun taas kromosomien 9p ja 10q puutoksia nähtiin useammin glioblastoomissa (gradus IV). Lisäksi osoitimme, että 1) metyloitunut MGMT-geeni esiintyy usein yhdessä IDH1-geenin mutaation ja kromosomin 19q puutoksen kanssa, 2) metyloitumaton MGMT-geeni kromosomien 9p ja 10q puutosten sekä kromosomin 7q monistuman kanssa 3) mutatoitunut IDH1-geeni metyloituneen MGMT-geenin sekä kromosomien 1p ja 1p/19q puutosten kanssa, sekä 4) mutatoitumaton IDH1-geeni kromosomin 10q puutoksen kanssa. Pyrosekvensointi osoittautui soveltuvan hyvin MGMT-geenin metyloitumisasteen määrittämiseen FFPE-materiaalista. Osatöissä II ja III vertasimme kohdennettua uuden sukupolven sekvensointia fluoresenssi in situ hybridisaatioon, immunohistokemialliseen värjäykseen ja käänteistranskriptaasi-PCR-menetelmään ALK-geenin fuusioiden tunnistamisessa (osatyö II), sekä PCR-menetelmään EGFR-, KRAS-, ja BRAF-geenimutaatioiden tunnistamisessa (osatyö III). Tuloksemme osoittavat, että käytetyt menetelmät soveltuvat FFPE-näytteille ja eri menetelmillä saadut tulokset vastaavat hyvin toisiaan. Lisäksi kohdennettu uuden sukupolven sekvensointi osoittautui hyödylliseksi tunnistettaessa uusia ja harvinaisia geenimuutoksia, joilla saattaa olla prediktiivistä arvoa. Osatyössä IV määritimme ALK-geenin fuusioiden esiintymisen suomalaisessa potilasaineistossa, joka koostui 469 ei-pienisoluista keuhkosyöpää sairastavasta potilaasta. Lisäksi tutkimme lähemmin ALK-geenin fuusiota kantavien potilaiden ominaisuuksia sekä fuusiogeenin esiintymistä 22 muun geenin mutaatioiden kanssa. Immunohistokemiallisen värjäyksen avulla määritimme ALK-geenin fuusioiden esiintyvän suhteellisen alhaisella frekvenssillä (2,3%) suomalaisissa keuhkosyöpäpotilaissa. ALK-positiiviset potilaat olivat merkittävästi nuorempia ja useammin täysin tupakoimattomia tai entisiä vähän tupakoivia. Vaikka suurin osa ALK-positiivisista kasvaimista oli adenokarsinoomia, ALK-geenin fuusioita havaittiin myös suurisoluisissa karsinoomissa. Kohdennetun uuden sukupolven sekvensoinnin avulla havaittiin ALK-geenin fuusioita esiintyvän yhdessä geeneissä MET, TP53, CTNNB1, ja PIK3CA esiintyvien mutaatioiden kanssa, mutta lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään näiden geenien yhteisesiintymisten merkitys. Tutkimuksemme osoittavat, että jotkin geneettiset ja epigeneettiset muutokset esiintyvät yhdessä. Näin ollen useita muutoksia samanaikaisesti tutkimalla voidaan saada kokonaisvaltaisempi kuva kasvaimen molekulaarisesta taustasta, mikä voi edesauttaa kasvaimen käytöksen, ennusteen ja hoitovasteen arvioimisessa. Lisäksi tuloksemme osoittavat pyrosekvensoinnin ja uuden sukupolven sekvensoinnin soveltuvuuden FFPE-kasvainkudosnäytteille, sekä kohdennetun uuden sukupolven sekvensoinnin tuoman hyödyn geenifuusioiden ja -mutaatioiden tunnistamisessa muihin käytettyihin menetelmiin verrattuna, kuten mahdollisuuden selvittää samanaikaisesti useita geenimuutoksia

Prevalence of RPGR-Mediated Retinal Dystrophy in an Unselected Cohort of Over 5000 Patients

Purpose: Comprehensive genetic testing for inherited retinal dystrophy (IRD) is challenged by difficult-to-sequence genomic regions, which are often mutational hotspots, such as RPGR ORF15. The purpose of this study was to evaluate the diagnostic contribution of RPGR variants in an unselected IRD patient cohort referred for testing in a clinical diagnostic laboratory. Methods: A total of 5201 consecutive patients were analyzed with a clinically validated next-generation sequencing (NGS)-based assay, including the difficult-to-sequence RPGR ORF15 region. Copy number variant (CNV) detection from NGS data was included. Variant interpretation was performed per the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines. Results: A confirmed molecular diagnosis in RPGR was found in 4.5% of patients, 24.0% of whom were females. Variants in ORF15 accounted for 74% of the diagnoses; 29% of the diagnostic variants were in the most difficult-to-sequence central region of ORF15 (c.2470-3230). Truncating variants made up the majority (91%) of the diagnostic variants. CNVs explained 2% of the diagnostic cases, of which 80% were one- or two-exon deletions outside of ORF15. Conclusions: Our findings indicate that high-throughput, clinically validated NGS-based testing covering the difficult-to-sequence region of ORF15, in combination with high-resolution CNV detection, can help to maximize the diagnostic yield for patients with IRD. Translational Relevance: These results demonstrate an accurate and scalable method for the detection of RPGR-related variants, including the difficult-to-sequence ORF15 hotspot, which is relevant given current and emerging therapeutic opportunities.Peer reviewe