Fungos endofíticos de Aristolochia triangularis (cipó-mil-homens) com potencial no controle biológico das doenças do morangueiro

Orientadora : Profª Drª Ida Chapaval PimentelCoorientadora : Profª Drª Rodrigo Makowiecky StuartDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 22/02/2017Inclui referências : f. 55-74Resumo: A cultura do morango é uma das mais importantes ao redor do mundo, tanto por sua relevância econômica como pela geração de empregos. Os frutos desta cultura são muito sensíveis, tornando comum o aparecimento de fungos fitopatogênico na pré e pós-colheita. Dois dos principais fungos fitopatogênicos que assolam esta cultura são o Botrytis cinerea (Pers.), causador do mofo cinzento e o Rhizopus stolonifer (Ehrenb.), causador da podridão do Rhizopus. Por serem doenças de fácil disseminação e difícil controle, acabam gerando a aplicação indiscriminada de agroquímicos, que causam danos ao bioma onde são aplicados e problemas à saúde do consumidor, tornando necessária a utilização de metodologias alternativas para controle destes patógenos, como o controle biológico. Um dos principais agentes de biocontrole são os fungos endofíticos, que apresentam imenso potencial para produzir metabólitos secundários, similares ou iguais à sua planta hospedeira, e quando isolados de plantas medicinais podem demonstrar diversas aplicações na indústria e medicina. A planta Aristolochia triangularis é amplamente utilizada na medicina popular como antiinflamatória, antimicrobiana, antimicobacteriana, dentre outras aplicações. Neste trabalho, buscamos isolar fungos endofíticos de A. triangularis e testar o potencial dos isolados em promover o controle biológico de B. cinerea e R. stolonifer e sua capacidade de produzir metabólitos secundários bioativos. Este é o primeiro relato de fungos endofíticos desta planta, o que torna este trabalho inédito neste contexto. Foram 263 fungos isolados do cipó, caule, fruto, folhas jovens e folhas maduras. A técnica de ARDRA foi realizada buscando um agrupamento molecular dos isolados, para tal foram utilizadas as enzimas de restrição Mbo I e Hae III. Um total de 26 padrões de haplótipos diferentes foram gerados, demonstrando grande diversidade molecular. 10% dos fungos de cada haplótipo, 50 no total, foram aleatoriamente selecionados e submetidos à sequenciamento do gene ITS. Foi detectada similaridade com os gêneros Colletotrichum, Fusarium, Xylaria, Trichoderma, Nectria, Phomopsis, Stenocarpella, Phylosticta, Ascochyta, Neurospora, Yarrowia, Gibberela e Botryosphaeria. O cálculo do índice de Shannon foi baseado no número de gêneros presentes em cada parte da planta. O cipó demonstrou maior diversidade (H': 1.4402), seguido pelo fruto (H': 1.0035), caule (H': 0.7889), folhas maduras (H': 0.2378) e folhas jovens (H': 0.2074). Após identificação dos gêneros e para avaliar seu potencial no biocontrole de B. cinerea e R. stolonifer, os 50 fungos sequenciados foram submetidos ao teste de cultura pareada. Destes, 13 isolados, pertencentes aos gêneros Trichoderma, Colletotrichum, Botryosphaeria, Stenocarpella, Nectria, Phomopsis e Gibberella, controlaram o crescimento de B. cinerea e 7 isolados, pertencentes aos gêneros Trichoderma, Botryosphaeria, Nectria, Phomopsis e Gibberella, controlaram o crescimento de R. stolonifer. Isto demonstra que os fungos isolados de A. triangularis são capazes de promover o antagonismo destes patógenos in vitro. Os 263 isolados foram submetidos à PCR para avaliação da presença do gene PKS I, que está intimamente relacionado à produção de metabólitos secundários bioativos em microrganismos. Sessenta e seis apresentaram a presença do gene e destes, seis promoveram o biocontrole in vitro de B. cinerea e R. stolonifer, podendo o biocontrole visualizado estar relacionado à produção de metabólitos secundários. Palavras-chave: Biocontrole. Endófitos. ARDRA. PKS I. Metabólitos secundários. Fragaria x ananassa Duchesne. Botrytis cinerea. Rhizopus stolonifer.Abstract: The strawberry culture is one of the most important cultures around the world. Its fruit is sensitive and susceptible to several pre- and post-harvest fungal diseases. Grey mold, caused by Botrytis cinerea (Pers.), and Rhizopus rot, caused by Rhizopus stolonifer (Ehreb.), are the most important strawberry diseases, due to their easy spread and difficult control. These and other factors lead to indiscriminate agrochemical applications, causing negative environmental impacts and health damage. Thus, alternative methods to control these pathogens are required, as biological control, which is based on using an organism to control the population density of another organism. One of the most representative group of biocontrol agents is the group of endophytic fungi. These organisms are capable to produce several bioactive metabolites and metabolites that are similar to those produced by their hosts. Therefore, the isolation of endophytic fungi from medicinal plants is an excellent strategy to find those fungi that are producers of bioactive metabolites. In this work, we evaluate the presence of endophytic fungi in the medicinal plant Aristolochia triangularis. This plant posses antiinflamatory, antimicrobial, antimycobacterium activities, among others. This is the first report of endophytic fungi isolated from A. triangularis. The total of 263 endophytes were isolated from fruit, vine, stem, young and mature leaves. These isolates were submitted to ARDRA technique, using Mbo I and Hae III restriction enzymes, to form groups based on genotypes differences. A total of 26 haplotypes were identified and 10% of the isolates of each haplotype, 50 in total, were selected for ITS sequencing. We found similarity with Colletotrichum, Fusarium, Xylaria, Trichoderma, Nectria, Phomopsis, Stenocarpella, Phylosticta, Ascochyta, Neurospora, Yarrowia, Gibberella and Botryosphaeria genus. Shennon diversity index was based on sequencing analysis and showed greater diversity on vine (H': 1.4402), followed by fruit (H': 1.0035), stem (H': 0.7889), mature leaves (H': 0.2378) and young leaves (H': 0.2074). After identification, we proceded the antagonism test in order to evaluate the capability of those 50 endophytes to promote the biological control of B. cinerea and R. stolonifer. Thirteen isolates distributed on Trichoderma, Colletotrichum, Botryosphaeria, Stenocarpella, Nectria, Phomopsis and Gibberella genus, showed activity against B. cinerea. Seven isolates distributed on Trichoderma, Botryosphaeria, Nectria, Phomopsis and Gibgerella genus showed activity against R. stolonifer. These data show that endophytic fungi isolated from A. triangularis are capable of promoting the biological control of these strawberry pathogens. All the 263 isolates were tested for the presence of PKS I gene, wich is related to the biochemical pathway responsible for producing bioactive compounds in fungi. Of these, 66 showed the presence of PKS I gene, and 6 were related to those that promoted in vitro biocontrol of strawberry diseases. The presence of PKS I gene, indicated that these isolates may produce several bioactive compounds that could be related to the biological control observed. Key-words: Biocontrol. Endophytes. ARDRA. PKS I. Secondary metabolites. Fragaria x ananassa Duchesne. Botrytis cinerea. Rhizopus stolonifer

Bioprospecção e avaliação da interação de fungos no controle de Duponchelia fovealis (Lepidoptera: Crambidae)

Orientadora: Profa. Dra. Ida Chapaval PimentelTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 30/07/2021Inclui referênciasResumo: O morango é amplamente consumido no mundo todo e constitui a principal fonte de renda de diversas famílias brasileiras. Um dos principais desafios desta cultura é a incidência de pragas, sendo a mariposa Duponchelia fovealis a que vem causando maiores danos atualmente. Por ser uma praga exótica no Brasil, ainda não existe controle químico ou biológico registrado para essa praga, o que acarreta o uso indiscriminado de agrotóxicos nesta cultura. Devido aos danos causados por estes produtos ao meio ambiente e a saúde humana, implementa-se o controle biológico como principal alternativa ao uso de produtos químicos, pois este possui grande efetividade sem causar danos. Estudos avançados dentro do controle biológico têm demonstrado que a associação de dois ou mais organismos é capaz de melhorar o controle de pragas e doenças agrícolas, além de trazer benefícios à planta e ao meio ambiente. Entretanto pesquisas avaliando a interação entre fungos entomopatogênicos, atuando como consórcio fúngico, ainda são uma lacuna neste campo de estudos, e pouco se sabe sobre a interação molecular de tais agentes de biocontrole e sua praga alvo. A metabolômica é uma das melhores alternativas para estudar estas interações, uma vez que sua abordagem é a que mais reflete as alterações fenotípicas causadas em resposta a alterações genéticas e ambientais. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de diferentes linhagens de fungos entomopatogênicos das espécies Beauveria bassiana, Isaria javanica e Purpureocillium lilacinum para formação de um consórcio fúngico capaz de aumentar a mortalidade de D. fovealis. Além disso, foram avaliadas as moléculas envolvidas na relação entre os fungos constituintes do consórcio, entre consórcio e lagartas mortas e também nas lagartas que sobreviveram à aplicação dos fungos, buscando entender melhor a interação molecular entomopatógeno-lagarta. Foi possível a obtenção de sete consórcios que demonstraram aumento no controle de lagartas de D. fovealis, quando comparados com as linhagens aplicadas separadamente, sendo o consórcio mais efetivo formado por duas linhagens de B. bassiana. Este consórcio foi selecionado para avaliação de metabolômica através de LC-MS/MS e GC-MS e foi possível a detecção de metabólitos que auxiliam a ação conjunta dos isolados, tanto na sua coexistência durante o processo de infecção como aqueles usados para suprimir o sistema imune da lagarta. Neste caso, foram observados três principais modos de ação: metabólitos antioxidantes, anti-inflamatórios e com ação inseticida. Foram também identificados marcadores de resposta de defesa do inseto, os quais podem estar diretamente envolvidos na sobrevivência de algumas lagartas frente ao ataque dos fungos.Abstract: Strawberries are widely consumed worldwide, and its farming is the main source of income for several Brazilian families. One of the main challenges of this culture is the incidence of pests and Duponchelia fovealis is nowadays, the most harmful. As it is an exotic pest, there is still no chemical or biological control registered for this pest in Brazil, which leads to indiscriminate use of pesticides in this crop. Due to the toxicity of these products, biological control is the main alternative with great effectiveness without causing environmental or health damage. Advanced studies have shown that the association of two or more microorganisms promote a better control of agricultural diseases, in addition to the plant benefits and environment. However, there are no previous studies evaluating the interaction between entomopathogenic fungi acting as a fungal consortium against insect pests. Besides little is known about the molecular interaction of such biocontrol agents and their target pest. Metabolomics is the main alternatives to evaluate those interactions, since its approach is the one that most reflects the phenotypic transitions caused in response to genetic and environmental changes. Thus, we seek evaluate the interaction of different entomopathogenic fungi of Beauveria bassiana, Isaria javanica and Purpureocillium lilacinum species to form a fungal consortium capable of increase D. fovealis mortality. In addition, we evaluate the molecules of consortium-infected D. fovealis, in order to a better understand of its molecular interaction. Seven consortia were able to increase D. fovealis biocontrol, when compared to the strains applied separately. A two-fungi consortium formed by two strains of B. bassiana was the most effective. This consortium was selected for metabolomics approach through GC-MS and LC-MS/ MS. The metabolites detected seems to be linked to fungal possible coexistence in the infection process, as well as some of them seems to be used by the fungi to escape D. fovealis immune system of. In this case, three mechanisms were identified as by the consortium metabolites: antioxidative, antiinflammatory and insecticidal. Other metabolites seem to be possible markers of the moth defense mechanism, directly involved in D. fovealis larvae survival of the consortium attack

Isolation of <i>Beauveria</i> Strains and Their Potential as Control Agents for <i>Lema bilineata</i> Germar (Coleoptera: Chrysomelidae)

Lema bilineata Germar (Coleoptera: Chrysomelidae) was recently reported to damage Physalis peruviana crops in Brazil. Given the potential for inflicting damage on other Solanaceae species and the lack of alternatives for controlling this pest, we assessed the pathogenicity of 15 Beauveria isolates against L. bilineata adults in vitro. In addition, three of these isolates were tested for their ovicidal effect against L. bilineata eggs. Fungal strains were isolated from mummified corpses of L. bilineata collected in a non-commercial field in Paraná, Brazil. The isolates were identified as Beauveria bassiana using molecular markers. Lema bilineata adults were susceptible to conidial suspensions of all these isolates at a concentration of 108 conidia mL−1. Deaths caused by fungal extrusion were confirmed. Three strains were found to be more virulent against L. bilineata adults and showed ovicidal effects. This is the first study on entomopathogenic fungi isolated from dead insects collected from P. peruviana crops and tested against L. bilineata carried out in Brazil. The results obtained in the laboratory indicate the high potential of the use of three B. bassiana strains against L. bilineata as a biocontrol agent