Funktionelle Charakterisierung der potenziellen Rolle des „Nonsense-mediated mRNA Decay“ (NMD)-Proteins „Up-Frameshift 1“ (UPF1) in der Translation

„Nonsense-Mediated mRNA Decay“ (NMD) ist ein translationsabhängiger Qualitätskontroll-mechanismus der post-transkriptionalen Genexpression in Eukaryonten. Durch NMD werden mRNAs mit vorzeitigen Stopkodons im offenen Leserahmen (ORF) erkannt und abgebaut, was durch die NMD-Effektorproteine UPF1, UPF2 und UPF3b vermittelt wird. Der Abbau aberran-ter mRNAs wird durch die vorzeitige Termination der Proteintranslation ausgelöst. Die dieser Funktion zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und insbesondere die Rolle der UPF-Proteine sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die auf die Interaktion des NMD-Faktors UPF1 mit den Translations-Terminationsfaktoren eRF1 und eRF3 folgende Phosphorylierung von UPF1 durch SMG1 scheint ein Schlüsselereig-nis zur Auslösung des Degradationsmechanismus zu sein. Es ist jedoch unbekannt, durch welche Abläufe hier zwischen normaler und vorzeitiger Termination unterschieden wird. Eine lange 3’-UTR, sowie ein „Exon-Junction-Complex“ (EJC) mehr als 22 Nukleotide stromabwärts des Terminationskodons dienen als Erkennungskriterien von NMD-Substraten. Daten aus S. cerevisiae deuten darauf hin, dass die Termination oder das Recycling der Ribosomen bei der Translation von NMD-Substraten aberrant ist. Die Grundhypothese der hier vorliegenden Arbeit postuliert, dass UPF1 durch seine Interak-tion mit dem Translationsapparat hier im Zentrum eines kinetischen Proofreading-Mechanismus steht, durch den die verschiedenen positiven (Nähe des Terminationsereignis-ses zum Poly-(A)-Schwanz und PABPC1) und negativen (EJC in der 3’-UTR) Terminationssigna-le integriert werden. UPF1 könnte also eine generelle Rolle bei der Termination spielen. Au-ßerdem wurde UPF1 in der Literatur eine negative regulatorische Rolle in der Translationsinitiation zugewiesen. Um die Rolle von UPF1 bei der Translation genauer aufzuschlüsseln, wurde hier ein aus HPLC-gereinigten Faktoren rekonstituiertes in vitro Translationssystem adaptiert. Durch Analyse in vitro assemblierter Translationskomplexe konnte ich feststellen, dass die Assemblierung von 48S-Initiationskomplexen, die Bindung der ribosomalen 60S-Untereinheit, die Elongation und die Termination der Translation sowie das Recycling der Ribosomen unabhängig von der An- oder Abwesenheit von UPF1 effizient ablaufen. In einem modifizierten Ansatz modulierte UPF1 in Gegenwart von geringen Mengen an Ter-minationsfaktoren die Dissoziation von aus Retikulozytenlysat gewonnenen Terminationsin-termediaten. Die hier vorgestellte Arbeit deutet auf eine Rolle von UPF1 bei der Feinabstim-mung der Translationstermination oder dem Recycling der Ribosomen nach der Termination im Kontext des mRNPs hin. Neben diesen Implikationen für den Translationsmechanismus im Allgemeinen könnten die hier gewonnenen Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von NMD leisten

Funktionelle Charakterisierung der potenziellen Rolle des „Nonsense-mediated mRNA Decay“ (NMD)-Proteins „Up-Frameshift 1“ (UPF1) in der Translation

„Nonsense-Mediated mRNA Decay“ (NMD) ist ein translationsabhängiger Qualitätskontroll-mechanismus der post-transkriptionalen Genexpression in Eukaryonten. Durch NMD werden mRNAs mit vorzeitigen Stopkodons im offenen Leserahmen (ORF) erkannt und abgebaut, was durch die NMD-Effektorproteine UPF1, UPF2 und UPF3b vermittelt wird. Der Abbau aberran-ter mRNAs wird durch die vorzeitige Termination der Proteintranslation ausgelöst. Die dieser Funktion zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und insbesondere die Rolle der UPF-Proteine sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die auf die Interaktion des NMD-Faktors UPF1 mit den Translations-Terminationsfaktoren eRF1 und eRF3 folgende Phosphorylierung von UPF1 durch SMG1 scheint ein Schlüsselereig-nis zur Auslösung des Degradationsmechanismus zu sein. Es ist jedoch unbekannt, durch welche Abläufe hier zwischen normaler und vorzeitiger Termination unterschieden wird. Eine lange 3’-UTR, sowie ein „Exon-Junction-Complex“ (EJC) mehr als 22 Nukleotide stromabwärts des Terminationskodons dienen als Erkennungskriterien von NMD-Substraten. Daten aus S. cerevisiae deuten darauf hin, dass die Termination oder das Recycling der Ribosomen bei der Translation von NMD-Substraten aberrant ist. Die Grundhypothese der hier vorliegenden Arbeit postuliert, dass UPF1 durch seine Interak-tion mit dem Translationsapparat hier im Zentrum eines kinetischen Proofreading-Mechanismus steht, durch den die verschiedenen positiven (Nähe des Terminationsereignis-ses zum Poly-(A)-Schwanz und PABPC1) und negativen (EJC in der 3’-UTR) Terminationssigna-le integriert werden. UPF1 könnte also eine generelle Rolle bei der Termination spielen. Au-ßerdem wurde UPF1 in der Literatur eine negative regulatorische Rolle in der Translationsinitiation zugewiesen. Um die Rolle von UPF1 bei der Translation genauer aufzuschlüsseln, wurde hier ein aus HPLC-gereinigten Faktoren rekonstituiertes in vitro Translationssystem adaptiert. Durch Analyse in vitro assemblierter Translationskomplexe konnte ich feststellen, dass die Assemblierung von 48S-Initiationskomplexen, die Bindung der ribosomalen 60S-Untereinheit, die Elongation und die Termination der Translation sowie das Recycling der Ribosomen unabhängig von der An- oder Abwesenheit von UPF1 effizient ablaufen. In einem modifizierten Ansatz modulierte UPF1 in Gegenwart von geringen Mengen an Ter-minationsfaktoren die Dissoziation von aus Retikulozytenlysat gewonnenen Terminationsin-termediaten. Die hier vorgestellte Arbeit deutet auf eine Rolle von UPF1 bei der Feinabstim-mung der Translationstermination oder dem Recycling der Ribosomen nach der Termination im Kontext des mRNPs hin. Neben diesen Implikationen für den Translationsmechanismus im Allgemeinen könnten die hier gewonnenen Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von NMD leisten

A network of SMG-8, SMG-9 and SMG-1 C-terminal insertion domain regulates UPF1 substrate recruitment and phosphorylation

Mammalian nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a eukaryotic surveillance mechanism that degrades mRNAs containing premature translation termination codons. Phosphorylation of the essential NMD effector UPF1 by the phosphoinositide-3-kinase-like kinase (PIKK) SMG-1 is a key step in NMD and occurs when SMG-1, its two regulatory factors SMG-8 and SMG-9, and UPF1 form a complex at a terminating ribosome. Electron cryo-microscopy of the SMG-1-8-9-UPF1 complex shows the head and arm architecture characteristic of PIKKs and reveals different states of UPF1 docking. UPF1 is recruited to the SMG-1 kinase domain and C-terminal insertion domain, inducing an opening of the head domain that provides access to the active site. SMG-8 and SMG-9 interact with the SMG-1 C-insertion and promote high-affinity UPF1 binding to SMG-1-8-9, as well as decelerated SMG-1 kinase activity and enhanced stringency of phosphorylation site selection. The presence of UPF2 destabilizes the SMG-1-8-9-UPF1 complex leading to substrate release. Our results suggest an intricate molecular network of SMG-8, SMG-9 and the SMG-1 C-insertion domain that governs UPF1 substrate recruitment and phosphorylation by SMG-1 kinase, an event that is central to trigger mRNA decay