Anaerober Abbau von Alkanen und Alkenen durch Sulfatreduzierer

Alkane und Alkene kommen als Bestandteile von Erdöl häufig in der Natur vor. Aufgrund der globalen Verschmutzung durch Erdöl bzw. daraus resultierenden Kraftstoffen, spielt der Abbau dieser Verbindungen eine große Rolle. Diese Kohlenwasserstoffe können aerob mit Hilfe bakterieller Mono- oder Dioxygenasen abgebaut werden. Bei den meisten bekannten anaeroben Bakterien, die Alkane abbauen können, erfolgt der Angriff über eine Fumarat-Addition. Es gibt einige Mikroorganismen, die Alkene anaerob über einen alternativen Mechanismus abbauen, zu dem bisher keine genaueren Details bekannt sind. Im Fall der Alkene sprechen die bisherigen Erkenntnisse für eine Hydratisierung der Doppelbindung als mögliche initiale Reaktion. Zu den am besten untersuchten anaeroben Bakterien, die sowohl Alkane als auch Alkene abbauen können, zählen die Sulfatreduzierer Desulfococcus oleovorans Stamm Hxd3 und Desulfatibacillum alkenivorans Stamm AK-01. D. alkenivorans Stamm AK-01 baut Alkane über Fumarat-Addition ab, während D. oleovorans einen unbekannten alternativen Mechanismus für den Alkanabbau benutzt, allerdings auch Gene für ein Enzym enthält, das hohe Ähnlichkeit zur Ethylbenzoldehydrogenase (EBDH) aus Aromatoleum aromaticum aufweist. Das Ziel dieser Arbeit war es, den anaeroben Abbau von Alkanen und Alkenen durch diese Sulfatreduzierer näher zu charakterisieren und die mögliche Beteiligung des in D. oleovorans gefundenen EBDH-ähnlichen Enzyms am anaeroben Alkan- oder Alkenbbau zu untersuchen. In D. oleovorans Zellen, die mit Hexadecan als Substrat wuchsen, wurden induzierte Proteine gefunden, die durch eine MALDI-TOF Analyse als Untereinheiten des EBDH-ähnlichen Enzyms identifiziert werden konnten. Dieses Enzym wurde in der vorliegenden Arbeit als Alkanhydroxylase bezeichnet, da es vermutlich für die Hydroxylierung des Alkans zum korrespondierenden iso-Alkohol verantwortlich ist. Das entsprechende Intermediat 2-Hexadecanol konnte tatsächlich auch in kleinen Mengen durch eine GC/MS Analyse nachgewiesen werden. Der Untersuchung des anaeroben Alkenabbaus durch Sulfatreduzierer wurde die Theorie zu Grunde gelegt, dass es sich bei der initialen Reaktion um eine Hydratisierung handeln könnte, wobei der korrespondierende 1-Alkohol entsteht. Durch die Analyse der Fettsäuremuster auf verschiedenen Substraten konnte festgestellt werden, dass besonders Alkene, aber auch iso-Alkohole im Gegensatz zu Alkanen von D. oleovorans bevorzugt werden. Das lässt vermuten, dass der Abbau von Alkanen für die Bakterienzellen mit einem höheren Energieverbrauch verbunden sein könnte. Die Gene der drei Untereinheiten der aktiven Alkanhydroxylase liegen mit weiteren Genen, die auf einen bc1-ähnlichen Komplex hindeuten, auf einem gemeinsamen apparenten Operon. Dies deutet daraufhin, dass diese Proteine einen gemeinsamen membranständigen Komplex bilden. Innerhalb des Komplexes werden dann wahrscheinlich die Elektronen aus der Hydroxylierung der Alkane, die im Periplasma stattfindet, auf Menachinon in der Membran übertragen. Es handelt sich dabei um einen endergonen Elektronentransfer, der wahrscheinlich mit einer Investition von Energie verbunden ist. Gegenüber D. oleovorans unterscheidet D. alkenivorans zwar auch zwischen Alkanen und Alkenen, aber nicht im gleichen Maße. Als induziertes Enzym in Hexadecan-Kulturen konnte einzig die Alkylsuccinatsynthase detektiert werden, welche die Addition von Fumarat an die Methylgruppe des Alkans katalysiert. Anhand der Fettsäuremuster konnte bestätigt werden, dass D. oleovorans im Gegensatz zu D. alkenivorans, welches Alkane durch Fumarat-Addition abbaut, einen anderen Abbaumechanismus haben muss. Beim Abbau eines ungeradkettigen 2-Alkohols wurden bei D. alkenivorans hauptsächlich geradkettige Fettsäuren detektiert. Wurde dahingegen ein ungeradkettiges Alkan abgebaut, entstanden hauptsächlich ungeradkettige Fettsäuren. Bei D. oleovorans wurden dahingegen sowohl beim Abbau eines ungeradkettigen Alkans, als auch eines ungeradkettigen 2-Alkohols geradkettige Fettsäuren detektiert. Das lieferte einen weiteren Hinweis darauf, dass der 2-Alkohol ein Abbauprodukt des Alkanmetabolismus in D. oleovorans ist. In Alken-abbauenden Kulturen beider Stämme konnten keine spezifisch induzierten Enzyme detektiert werden. Es wurde aber gezeigt, dass das jeweils initiale Enzym des Alkenabbaus in D. oleovorans und D. alkenivorans nicht Wolfram abhängig ist, wie die Acetylenhydratase aus Pelobacter acetylenicus, welche die Addition von Wasser an die Dreifachbindung von Acetylen katalysiert. Potentielle Gene aus D. oleovorans, die für ein Acetylenhydratase-ähnliches Enzym zum Abbau von Alkenen kodieren, wurden in einen selbst isolierten Pseudomonas stutzeri Stamm eingebracht, der 1-Hexadecanol, aber kein Hexadecen, abbauen kann. Es wurde gezeigt, dass Wachstum auf Hexadecen unter aeroben Bedingungen mit zwei der potentiellen Gene, die für das mögliche Enzym des initialen Schritts des Alkenabbaus codieren, wahrscheinlich möglich war

Anaerober Abbau von Alkanen und Alkenen durch Sulfatreduzierer

Alkane und Alkene kommen als Bestandteile von Erdöl häufig in der Natur vor. Aufgrund der globalen Verschmutzung durch Erdöl bzw. daraus resultierenden Kraftstoffen, spielt der Abbau dieser Verbindungen eine große Rolle. Diese Kohlenwasserstoffe können aerob mit Hilfe bakterieller Mono- oder Dioxygenasen abgebaut werden. Bei den meisten bekannten anaeroben Bakterien, die Alkane abbauen können, erfolgt der Angriff über eine Fumarat-Addition. Es gibt einige Mikroorganismen, die Alkene anaerob über einen alternativen Mechanismus abbauen, zu dem bisher keine genaueren Details bekannt sind. Im Fall der Alkene sprechen die bisherigen Erkenntnisse für eine Hydratisierung der Doppelbindung als mögliche initiale Reaktion. Zu den am besten untersuchten anaeroben Bakterien, die sowohl Alkane als auch Alkene abbauen können, zählen die Sulfatreduzierer Desulfococcus oleovorans Stamm Hxd3 und Desulfatibacillum alkenivorans Stamm AK-01. D. alkenivorans Stamm AK-01 baut Alkane über Fumarat-Addition ab, während D. oleovorans einen unbekannten alternativen Mechanismus für den Alkanabbau benutzt, allerdings auch Gene für ein Enzym enthält, das hohe Ähnlichkeit zur Ethylbenzoldehydrogenase (EBDH) aus Aromatoleum aromaticum aufweist. Das Ziel dieser Arbeit war es, den anaeroben Abbau von Alkanen und Alkenen durch diese Sulfatreduzierer näher zu charakterisieren und die mögliche Beteiligung des in D. oleovorans gefundenen EBDH-ähnlichen Enzyms am anaeroben Alkan- oder Alkenbbau zu untersuchen. In D. oleovorans Zellen, die mit Hexadecan als Substrat wuchsen, wurden induzierte Proteine gefunden, die durch eine MALDI-TOF Analyse als Untereinheiten des EBDH-ähnlichen Enzyms identifiziert werden konnten. Dieses Enzym wurde in der vorliegenden Arbeit als Alkanhydroxylase bezeichnet, da es vermutlich für die Hydroxylierung des Alkans zum korrespondierenden iso-Alkohol verantwortlich ist. Das entsprechende Intermediat 2-Hexadecanol konnte tatsächlich auch in kleinen Mengen durch eine GC/MS Analyse nachgewiesen werden. Der Untersuchung des anaeroben Alkenabbaus durch Sulfatreduzierer wurde die Theorie zu Grunde gelegt, dass es sich bei der initialen Reaktion um eine Hydratisierung handeln könnte, wobei der korrespondierende 1-Alkohol entsteht. Durch die Analyse der Fettsäuremuster auf verschiedenen Substraten konnte festgestellt werden, dass besonders Alkene, aber auch iso-Alkohole im Gegensatz zu Alkanen von D. oleovorans bevorzugt werden. Das lässt vermuten, dass der Abbau von Alkanen für die Bakterienzellen mit einem höheren Energieverbrauch verbunden sein könnte. Die Gene der drei Untereinheiten der aktiven Alkanhydroxylase liegen mit weiteren Genen, die auf einen bc1-ähnlichen Komplex hindeuten, auf einem gemeinsamen apparenten Operon. Dies deutet daraufhin, dass diese Proteine einen gemeinsamen membranständigen Komplex bilden. Innerhalb des Komplexes werden dann wahrscheinlich die Elektronen aus der Hydroxylierung der Alkane, die im Periplasma stattfindet, auf Menachinon in der Membran übertragen. Es handelt sich dabei um einen endergonen Elektronentransfer, der wahrscheinlich mit einer Investition von Energie verbunden ist. Gegenüber D. oleovorans unterscheidet D. alkenivorans zwar auch zwischen Alkanen und Alkenen, aber nicht im gleichen Maße. Als induziertes Enzym in Hexadecan-Kulturen konnte einzig die Alkylsuccinatsynthase detektiert werden, welche die Addition von Fumarat an die Methylgruppe des Alkans katalysiert. Anhand der Fettsäuremuster konnte bestätigt werden, dass D. oleovorans im Gegensatz zu D. alkenivorans, welches Alkane durch Fumarat-Addition abbaut, einen anderen Abbaumechanismus haben muss. Beim Abbau eines ungeradkettigen 2-Alkohols wurden bei D. alkenivorans hauptsächlich geradkettige Fettsäuren detektiert. Wurde dahingegen ein ungeradkettiges Alkan abgebaut, entstanden hauptsächlich ungeradkettige Fettsäuren. Bei D. oleovorans wurden dahingegen sowohl beim Abbau eines ungeradkettigen Alkans, als auch eines ungeradkettigen 2-Alkohols geradkettige Fettsäuren detektiert. Das lieferte einen weiteren Hinweis darauf, dass der 2-Alkohol ein Abbauprodukt des Alkanmetabolismus in D. oleovorans ist. In Alken-abbauenden Kulturen beider Stämme konnten keine spezifisch induzierten Enzyme detektiert werden. Es wurde aber gezeigt, dass das jeweils initiale Enzym des Alkenabbaus in D. oleovorans und D. alkenivorans nicht Wolfram abhängig ist, wie die Acetylenhydratase aus Pelobacter acetylenicus, welche die Addition von Wasser an die Dreifachbindung von Acetylen katalysiert. Potentielle Gene aus D. oleovorans, die für ein Acetylenhydratase-ähnliches Enzym zum Abbau von Alkenen kodieren, wurden in einen selbst isolierten Pseudomonas stutzeri Stamm eingebracht, der 1-Hexadecanol, aber kein Hexadecen, abbauen kann. Es wurde gezeigt, dass Wachstum auf Hexadecen unter aeroben Bedingungen mit zwei der potentiellen Gene, die für das mögliche Enzym des initialen Schritts des Alkenabbaus codieren, wahrscheinlich möglich war