Development of the specific spectral methods towards searching new markers of selected diseases in clinical samples

Wyniki pomiarów chemicznych są wykorzystywane w wielu obszarach, między innymi: w przemyśle, przy ocenie składu surowców, półproduktów i produktów czy w kontroli zanieczyszczeń środowiska. Analiza chemiczna jest również doskonałym narzędziem wspomagającym poszukiwania surowców geologicznych, badania materiałów związanych z rozwojem atomistyki czy badania związane z dziedzictwem kulturowym. Warto podkreślić, że ogromny rozwój technik pomiarowych w dziedzinie analizy chemicznej jaki nastąpił w XX wieku, przyczynił się do dużego zainteresowania ich zastosowaniem w badaniach medycznych. Z jednej strony jest to związane z ulepszeniem rutynowych testów pozwalających na ocenę stanu zdrowia człowieka, ale również z rozwojem badań ukierunkowanych na poszukiwanie nowych wskaźników stanów chorobowych. Pomiary chemiczne mają również zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, zarówno przy rutynowej kontroli jakości produkcji, jak również w badaniach związanych z opracowywaniem nowych leków i sposobów ich wytwarzania. Niewątpliwie, rozwój nowych technik pomiarowych i wyposażenie przyrządów w komputerowe systemy do ich obsługi, pozwalają na usprawnienie procedur pomiarowych. Warto przy tym podkreślić, że wbrew mylnemu często przekonaniu, że automatyzacja rozwiązuje wszelkie problemy, to uzyskiwanie miarodajnych wyników oraz ich właściwa interpretacja wymagają dużej wiedzy, doświadczenia oraz współpracy interdyscyplinarnej. Niewątpliwie chemik analityk musi posiadać umiejętność obsługi najnowocześniejszych urządzeń pomiarowych, ale przede wszystkim rozumieć procesy fizyko-chemiczne zachodzące podczas pomiaru, aby móc w sposób wiarygodny określić potencjalne źródła błędów. Dodatkowo, aby właściwie wybrać procedurę pomiarową, musi znać cel badań i mieć pełną świadomość każdego etapu prowadzonych badań. Badania poświęcone kontroli stanu zdrowia człowieka warunkują potrzebę oznaczania stężenia pierwiastków na poziomie śladowym, co jest możliwe tylko dzięki wykorzystaniu bardzo precyzyjnych i czułych urządzeń pomiarowych. Poznanie poziomu na jakim wstępują pierwiastki w organizmie ludzkim czy ich rozmieszczenia w tkankach oraz poznanie procesów biochemicznych występujących w organizmie żywym wyznaczają kierunek rozwoju współczesnej chemii analitycznej, w tym analizy klinicznej. W rozprawie doktorskiej została przedstawiona istota szeroko rozumianych badań interdyscyplinarnych poprzez przedstawienie trzech różnych historii, trzech różnych problemów i trzech różnych podejść chemika analityka, które pozwoliły odpowiedzieć na część pytań z zakresu medycyny i tym samym przyczynić się do lepszego poznania wybranych jednostek chorobowych czy zaburzeń organizmu. W części literaturowej niniejszej pracy przedstawione zostały zagadnienia dotyczące analizy klinicznej oraz przybliżona została charakterystyka analityczna procedur pomiarowych. W pierwszej części opisane zostały zarówno rutynowo stosowane metody diagnostyczne jak i najczęściej wykorzystywane do tych celów próbki kliniczne. Przedstawiono również jakie najważniejsze informacje dotyczące stanu zdrowia można otrzymać poprzez sprawdzenie wybranych parametrów krwi i moczu, podkreślając tym samym znaczenie rutynowych badań diagnostycznych. Przedstawiono także alternatywne próbki kliniczne wraz z informacjami, jakie można uzyskać poprzez ich analizę. Opisano również badania próbek klinicznych, które nie są stosowane rutynowo w laboratoriach klinicznych, jednak mogą dostarczać wielu informacji i stać się cennym narzędziem diagnostycznym w dziedzinie medycyny. Ostatnim poruszanym tematem była charakterystyka analityczna procedur i metod pomiarowych, w której przybliżono schemat postępowania analitycznego prowadzącego do uzyskania jak najbardziej rzetelnych, wiarygodnych i użytecznych wyników. W pracy eksperymentalnej opisano trzy projekty interdyscyplinarne, których głównym celem było stworzenie indywidualnych procedur analitycznych mających na celu znalezienie specyficznych wskaźników wybranych jednostek chorobowych w próbkach klinicznych Każdy ze zrealizowanych projektów zaczyna się krótkim wprowadzeniem i ogólnym przedstawieniem problemu. Zabieg ten miał na celu przybliżenie, jakie informacje przed przystąpieniem do realizacji projektu należało uzyskać z prowadzonych badań interdyscyplinarnych z lekarzami i naukowcami. Sprecyzowanie celu analitycznego pozwoliło na dobór odpowiedniej procedury analitycznej, takiej aby uzyskane wyniki były przydatne. Pierwszy projekt dotyczył stworzenia procedury oznaczania całkowitej zawartości ołowiu w próbkach krwi i osocza, która byłaby szybka oraz względnie tania z powodu możliwości analizy dużej liczby próbek. Dodatkowo procedura musiała uwzględniać nie tylko małe ilości próbek przeznaczonych do badań, ale również musiała być bardzo czuła ze względu na niskie stężenia oznaczanego pierwiastka w próbkach. Utrudnieniem była bardzo mała ilość dostarczonych do badań próbek. Prowadzone pomiary były etapem dużego projektu, w którym sprawdzano wpływ palenia papierosów na poziom ołowiu we krwi i w osoczu. Badaną grupą były kobiety w ciąży, które paliły papierosy przez cały okres trwania ciąży. Grupę kontrolną stanowiły ciężarne kobiety niepalące. Poziom pierwiastka sprawdzany był we wszystkich trymestrach ciąży. Otrzymane wyniki pozwoliły odpowiedzieć na pytanie, czy istnieje korelacja pomiędzy zawartością ołowiu we krwi i w osoczu, a liczbą wypalanych dziennie papierosów i niską masą urodzeniową dziecka. Badania te miały na celu potwierdzenie negatywnego wpływu nadmiernej ekspozycji na ołów na rozwój prenatalny. Badania były prowadzone przy ścisłej współpracy z Instytutem Matki i Dziecka w Warszawie. Drugi projekt był częścią interdyscyplinarnych badań dotyczących rzadkiej choroby Wilsona. Celem prowadzonych badań w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie odpowiedniej procedury analitycznej pozwalającej na otrzymanie wiarygodnych wyników dotyczących zawartości miedzi, żelaza, cynku i manganu w tkankach pochodzących z wybranych rejonów mózgu osób chorych na chorobę Wilsona. Największa trudność przy opracowaniu procedury spowodowana była niewielkimi rozmiarami próbek, co uniemożliwiało na przykład mineralizację wspomaganą promieniowaniem mikrofalowym w systemie zamkniętym, którą zwykle stosuje się w przypadku rozkładu próbek biologicznych w tym klinicznych. Dodatkową trudnością brak dostępnego komercyjnie materiału odniesienia, którego matryca byłaby idealnie spójna z badaną. Badania były prowadzone przy współpracy z Instytutem Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie. Celem ostatniego projektu było opracowanie procedury pozwalającej na określenie rozmieszczenia wybranych pierwiastków (Mg, Cu, Zn, Mn, Fe) w tkankach jajników ludzkich. Taka procedura pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie, czy istnieją zależności pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w próbce pochodzącej od osoby zdrowej oraz w próbce pobranej od osoby u której stwierdzono obecność zmian nowotworowych i tym samym wzbogacić dotychczasową wiedzę na temat nowotworów jajnika. Największą trudność w opracowywaniu procedury analitycznej był dobór optymalnych warunków, w których prowadzona była ablacja laserowa, ze względu na złożoną i niejednorodną matrycę próbek i brak komercyjnie dostępnych materiałów odniesienia. Po optymalizacji procedury podjęto próbę znalezienia ewentualnych różnic i korelacji pomiędzy rozmieszczeniem wybranych pierwiastków w tkankach zdrowych i objętych choroba nowotworową. Badania prowadzone były przy współpracy z Wojskowym Instytutem Medycznym w Warszawie. Niniejsza praca miała na celu pokazanie możliwości wykorzystania technik analitycznych do rozwiązywania problemów i odpowiedzi na pytania z zakresu medycyny, stworzenie procedur dedykowanych konkretnym badaniom, próbkom i problemom. Poprzez opisanie trzech różnych historii chciałam dodatkowo podkreślić jak duży wpływ na rozwój współczesnej medycyny mogą mieć badania interdyscyplinarne, jak ważna jest ścisła współpraca z innymi jednostkami i instytucjami oraz jak istotne jest indywidualne podejście do badań z pogranicza nauk. Rezultaty badań przedstawione w rozprawie doktorskiej zostały opublikowane w postaci sześciu publikacji oryginalnych 1. Dusek P., Bahn E., Litwin T., Jabłonka-Salach K., Łuciuk A., Huelnhagen T., Madai V.I., Dieringer M., Knauth M., Niendorf T., Sobesky J., Paul F., Schneider S.A., Czlonkowska A., Brück W., Wegner C., Wuerfel J., „Brain iron accumulation in Wilson disease: a post-mortem 7 Tesla MRI - histopathological study”, Annals of Neurology – w druku 2. Walter U., Skowrońska M., Litwin T., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Skoloudík D., Bulska E., Członkowska A., „Lenticular nucleus hyperechogenicity in Wilson’s disease reflects local copper but not iron accumulation”, Journal of Neural Transmission, 121 (2014) 1273-1279 3. Chełchowska M., Ambroszkiewicz J., Jabłonka-Salach K., Gajewska J., Maciejewski T.M., Bulska E., Laskowska-Klita T., Leibschang J., „Tobacco smoke exposure during pregnancy increases maternal blood lead levels affecting neonate birth weight”, Biol. Trace. Elem. Res., 155 (2013) 169-175; 4. Przybyłkowski A., Gromadzka G., Wawer A., Bulska E., Jabłonka-Salach K., Grygorowicz T., Schnejder-Pachołek A., Członkowski A., „Neurochemical and Behavioral Characteristics of Toxic Milk Mice: An Animal Model of Wilson's Disease”, Neurochem Res, 38 (2013) 2037-2045 5. Litwin T., Gromadzka G., Szpak G.M., Jabłonka-Salach K., Bulska E., Członkowska A., „Brain metal accumulation in Wilson's disease”, Journal of the Neurological Sciences, 329 (2013) 55-58; 6. Chełchowska M., Jabłonka-Salach K., Ambroszkiewicz J., Maciejewski T., Gajewska J., Bulska E., Laskowska-Kalita T., Leibschang J., Barciszewski J., „Wpływ palenia tytoniu na poziom ołowiu we krwi kobiet ciężarnych”, Medycyna Wieku Rozwojowego, 3 (2012) 196-204The aim of this work was to elaborate specific analytical procedures supporting the evaluation of novel disease’s markers. In the frame of human health control there is a need to monitor trace elements occurrence, which is possible only though the use of very precise and sensitive methods. In this work the possibilities of using the facilities of modern analytical instrumentation towards obtaining medically relevant information was described. Especially, the specific analytical procedures tailored with respect of fit for purposes approach was used in order to overcome the difficulties with sample preparation and calibration. In the work three study-cases were elaborated, as to demonstrate various kinds of problems arising whenever interdisciplinary research is conducted, here in the field of contemporary medicine. Furthermore, to illustrate how important close cooperation between other units and institutions is as well as to stress the significance of individual interdisciplinary approach. The first part of research was focused on the development of massive procedure enabling the determining of the content of lead in blood and plasma samples, which should be inexpensive (because of the large number of samples), relatively fast and sensitive (because of low level of lead in those samples). One should be also aware of the small quantity of the aliquot available for conducting measurements. The necessity to develop the reliable and fast screening procedure was part of a large project aiming to evaluate the influence of cigarette smoking on the content of lead in whole blood and plasma of selected group of patients. The group examined were pregnant women who were active smokers throughout pregnancy. The control group consisted of pregnant but non-smoking women. The concentration of the element was monitored in all trimesters of pregnancy. The results obtained answer the question about the correlation between the level of lead in whole blood and plasma, the number of cigarette smoked daily and the low weight of the newborn children. The research was to confirm the negative influence of excessive exposition to lead on the prenatal development. The research was carried out in cooperation with Mother and Child Institute in Warsaw. The second area of research was part of interdisciplinary approach to investigate the reason of Wilson`s Disease. It aimed at answering the question whether, and if so which, elements beside copper are responsible for the symptoms and development of the disease. The objective of this dissertation was to elaborate a non-routine novel analytical procedure which would allow us to receive reliable results on the concentration of copper, iron, zinc and manganese in the tissues from different parts of human brain; all originating from the patients with Wilson`s Disease. The biggest difficulty in working out the procedure resulted from small sample quantities. This made it impossible to apply? microwave digestion, which is commonly used in decomposing biological and clinical samples. Another difficulty was the lack of commercially available reference material whose matrix would be ideally consistent with the sample examined. The research was carried out in cooperation with the Institute Psychiatry and Neurology in Warsaw. The aim of the third part of research was to elaborate and validate fully novel procedure which would allow mapping selected elements distribution over the tissues of human ovaries. It was expected that with such a procedure it would be possible to evaluate the correlation between the distribution of selected elements over the ovaries cross sections. Moreover, the comparison of the distribution maps between healthy human tissues and those from a person with cancer would broaden our knowledge on ovaries cancer. The biggest difficulty in establishing the analytical procedure was optimisation of conditions of laser ablation for ovaries tissues. It was due to the complex and heterogeneous sample matrix and the lack of commercially available reference material. After optimising the procedure an attempt was made towards finding the possible differences and correlation between heathy and cancerous tissues. The research was carried out in cooperation with Military Institute of Medicine in Warsaw