The effect of DNA methyltransferase 3A suppression in progression of the resistance phenotype in breast cancer cells

Introduction. Rearrangement of molecular pathways and activation of bypass signaling determine the progression of tumor cell resistance to various drugs. Study of the common features of resistant formation mechanisms is essential for breast and other cancer beneficial treatments.Materials and methods. The present work was performed on estrogen receptor α ERα-positive (ERα – estrogen receptor α) McF-7 breast cancer cells, established sublines resistant to the mTOR inhibitor rapamycin or antiestrogen tamoxifen, and ERα-negative MDA-MB-231 breast cancer cells. Methods used include MTT test, transient transfection, immunoblotting, real-time polymerase chain reaction and methylation analysis by bisulfite pyrosequencing.Results. We have shown that the resistance of breast cancer cells to targeted and hormonal drugs is associated with the suppression of DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) and respective changes in DNA methylation; DNMT3A knockdown results in the partial resistance to both drugs demonstrating the pivotal role of DNMT3A suppression in the progression of cell resistance.Conclusion. Totally, the results obtained highlight the possible mechanism of tumor cell resistance to targeting/hormonal drugs based on the deregulation of DNMTs expression and demonstrate  direct connection between DNMT3A suppression and resistance progression

Diagnostic potential of miRNA-135A1 in human papillomavirus associated cervical lesions

Introduction. Human papillomavirus (HPV) infection with high-risk HPVs is an etiological factor in the development of cervical cancer, with HPV type 16 (HPV16) being the most common. The mechanisms leading to disruption of viral oncogene expression and initiation of epithelial cell transformation are poorly understood. Epigenetic regulatory factors, including cellular miRNAs, may play an important role in HPV-induced carcinogenesis, and aberrantly expressed miRNAs may be promising markers for the diagnosis of HPV-associated lesions.Aim. To search for miRNAs involved in the pathogenesis of HPV16-associated cervical cancer and to evaluate their diagnostic potential for the detection of cervical cancer and precancerous lesions.Materials and methods. MiRNA expression in clinical samples was assessed by both next generation sequencing and quantitative stem-loop polymerase chain reaction (sl-qPCR). Plasma miRNAs from patients with precancerous and cancerous lesions and healthy donors were analyzed using sl-qPCR. Loss of heterozygosity in cervical cancer samples was assessed by copy number ratio of MIR135A1 and ACTB genes. A total of 67 patients with cervical cancer, 21 with precancerous cervical lesions and 24 healthy donors were included in the study. The effect of DNA methylation on miRNA-135A1 expression was evaluated after treatment with a demethylating agent of the cervical HPV16-positive SiHa cell line. Changes in the expression of the HPV16 E6 oncogene were analyzed after transfection with synthetic analogues of the mature forms of miRNA-135А1 (miRNA-135a-3p and miRNA-135a-5p).Results. A significant decrease in the expression of miRNA-135A1 and miRNA-135A2 was detected in tumor tissue samples from HPV16-positive cervical cancer, which was confirmed by sl-qPCR in an independent panel of tumor samples. A decrease in miRNA-135A1 expression was shown to result from both loss of heterozygosity of the gene and aberrant DNA methylation. Transfection of mature forms of miRNA-135A1 into SiHa cells resulted in decreased expression of the E6 oncogene of HPV16. Blood plasma samples from patients with cervical cancer and precancerous lesions showed lower levels of miRNA-135a-3p than healthy donors, and ROC analysis indicated its high diagnostic potential.Conclusion. Levels of miRNA-135A1 are significantly reduced in cervical lesions, both in tumor tissue and plasma, and the ability of this miRNA to suppress the expression of the HPV16 E6 oncogene suggests its oncosuppressive properties. Thus, miRNA-135A1 can be used as a promising new marker for the diagnosis of HPV-associated lesions

Феномен подавления ДНК-метилтрансферазы 3А при формировании резистентного фенотипа в клетках рака молочной железы

Introduction. Rearrangement of molecular pathways and activation of bypass signaling determine the progression of tumor cell resistance to various drugs. Study of the common features of resistant formation mechanisms is essential for breast and other cancer beneficial treatments.Materials and methods. The present work was performed on estrogen receptor α ERα-positive (ERα – estrogen receptor α) McF-7 breast cancer cells, established sublines resistant to the mTOR inhibitor rapamycin or antiestrogen tamoxifen, and ERα-negative MDA-MB-231 breast cancer cells. Methods used include MTT test, transient transfection, immunoblotting, real-time polymerase chain reaction and methylation analysis by bisulfite pyrosequencing.Results. We have shown that the resistance of breast cancer cells to targeted and hormonal drugs is associated with the suppression of DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) and respective changes in DNA methylation; DNMT3A knockdown results in the partial resistance to both drugs demonstrating the pivotal role of DNMT3A suppression in the progression of cell resistance.Conclusion. Totally, the results obtained highlight the possible mechanism of tumor cell resistance to targeting/hormonal drugs based on the deregulation of DNMTs expression and demonstrate  direct connection between DNMT3A suppression and resistance progression.Введение. Переключение сигнальных путей и активация параллельных сигнальных каскадов относятся к ключевым факторам, определяющим развитие резистентности опухолевых клеток, и изучение механизмов подобной реаранжировки является одной из актуальных задач современной онкологии.Материалы и методы. Настоящая работа выполнена на ERα-положительных  (ERα – эстрогеновый рецептор α) клетках рака молочной железы MCF-7 и полученных из них сублиниях, устойчивых к ингибитору mTOR рапамицину или антиэстрогену тамоксифену, а также на ERα-отрицательных клетках рака молочной железы MDA-MB-231. Используемые методы включают тест МТТ, транзиторную трансфекцию, иммуноблоттинг, полимеразную цепную реакцию в реальном времени и анализ метилирования с помощью бисульфитного пиросеквенирования.Результаты. Мы показали, что резистентность клеток рака молочной железы к таргетным и гормональным препаратам связана с подавлением ДНК-метилтрансферазы 3А (DNMT3A) и соответствующими изменениями в метилировании ДНК. Нокдаун DNMT3A приводит к частичной резистентности к обоим препаратам, что демонстрирует ключевую роль подавления DNMT3A в развитии резистентности опухолевых клеток.Заключение. В целом, полученные результаты свидетельствуют о возможном механизме формирования устойчивости опухолевых клеток к таргетным/гормональным препаратам, основанном на дерегуляции экспрессии DNMT, и демонстрируют прямую связь между подавлением DNMT3A и развитием резистентности

Up-regulation of expression and lack of 5' CpG island hypermethylation of p16 INK4a in HPV-positive cervical carcinomas

BACKGROUND: High risk type human papilloma viruses (HR-HPV) induce carcinomas of the uterine cervix by expressing viral oncogenes E6 and E7. Oncogene E7 of HR-HPV disrupts the pRb/E2F interaction, which negatively regulates the S phase entry. Expression of tumor suppressor p16(ink4a )drastically increases in majority of HR-HPV associated carcinomas due to removal of pRb repression. The p16(ink4a )overexpression is an indicator of an aberrant expression of viral oncogenes and may serve as a marker for early diagnostic of cervical cancer. On the other hand, in 25–57% of cervical carcinomas hypermethylation of the p16 INK4a promoter has been demonstrated using a methylation-specific PCR, MSP. To evaluate a potential usage of the p16 INK4a 5' CpG island hypermethylation as an indicator of tumor cell along with p16(ink4a )overexpression, we analyzed the methylation status of p16 INK4a in cervical carcinomas METHODS: Methylation status of p16 INK4a was analyzed by MSP and by bisulfite-modified DNA sequencing. The expression of p16(ink4a )was analyzed by RT-PCR and by immunohistochemical technique. RESULTS: The extensive methylation within p16 INK4a 5' CpG island was not detected either in 13 primary cervical carcinomas or in 5 cancer cell lines by bisulfite-modified DNA sequencing (including those that were positive by MSP in our hands). The number and distribution of rare partially methylated CpG sites did not differ considerably in tumors and adjacent normal tissues. The levels of the p16 INK4a mRNA were increased in carcinomas compared to the normal tissues independently of the number of partially methylated CpGs within 5'CpG island. The transcriptional activation of p16 INK4a was accompanied by p16(ink4a )cytoplasmic immunoreactivity in the majority of tumor cells and presence of a varied number of the p16 positive nuclei in different tumors. CONCLUSION: Hypermethylaion of the p16INK4a 5' CpG island is not a frequent event in HR-HPV-positive cervical carcinomas and cannot be an effective marker of cancer cells with up-regulated expression of p16(ink4a). Our data confirm other previous studies claiming specific p16INK4a up-regulation in the majority of cervical carcinomas at both the protein and mRNA levels. Cytoplasmic accumulation of p16(ink4a )is a feature of cervical carcinomas

Мутации изоцитратдегидрогеназ 1 и 2 и ме тилирование гена MGMT в глиомах

Gliomas are the most common brain tumors. It is difficult to detect them at early stages of disease and there is a few available therapies providing significant improvement in survival. Mutations of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 genes (IDH1 and IDH2) play significant role in gliomogenesis, diagnostics and selection of patient therapy. We tested the distribution of IDH1 and IDH2 mutations in gliomas of different histological types and grades of malignancy by DNA melting analysis using our protocol with a sensitivity of 5 %. The results of this assay were confirmed by conventional Sanger sequencing. IDH1/2 mutations were detected in 74 % of lower grade gliomas (II and III, World Health Organization) and in 14 % of glioblastomas (IV, World Health Organization). Mutation rate in gliomas with oligodendroglioma component were significantly higher then in other glioma types (р = 0.014). The IDH1 mutations was the most common (79 % of general mutation number). IDH1/2 mutations can induce aberrant gene methylation. Detection of methylation rate of the gene encoding for O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), predictive biomarker for treatment of gliomas with the alkylating agents, has demonstrated a partial association with IDH1/2 mutations. In 73 % of IDH1/2-mutant tumors MGMT promoter methylation were observed. At the same time IDH1/2 mutations were not revealed in 67 % tumors with MGMT promoter methylation. These results indicate existence of another mechanism of MGMT methylation in gliomas. Our data strong support for necessity of both markers testing when patient therapy is selected.Глиомы – наиболее распространенные опухоли головного мозга, трудно поддающиеся ранней диагностике и лечению. Мутации в генах изоцитратдегидрогеназ 1 и 2 (IDH1 и IDH2) играют существенную роль в глиомогенезе, диагностике и выборе терапии пациентов. Было исследовано распределение мутаций IDH1 / 2 в глиомах различных гистологических типов и степеней злокачественности методом анализа кривых плавления ДНК с зондами TaqMan по разработанному нами протоколу, позволяющему определять мутации с чувствительностью 5 %. Специфичность определения мутаций подтверждена секвенированием по Сэнгеру. В глиомах II и III степеней злокачественности по классификации Всемирной организации здравоохранения частота мутаций IDH1 / 2 составила 74 %, в глиобластомах (IV степень злокачественности) – 14 %. Глиомы, содержащие клетки с олигодендроцитарным типом дифференцировки, достоверно чаще имели мутации IDH1 / 2, чем другие типы глиом (р = 0,014). Преобладающим типом мутаций являются мутации IDH1 (79 % от общего числа мутаций). Одно из последствий мутаций IDH1 / 2 – индукция аберрантного метилирования генов. Анализ метилирования промотора гена О6‑метилгуанин-ДНК-метил-трансферазы (MGMT, O6‑methylguanine-DNA-methyltransferase), предсказательного маркера чувствительности глиом к терапии алкилирующими агентами у тех же больных, показал частичную ассоциацию с мутациями IDH1 / 2. В 73 % случаев с мутациями IDH1 / 2 наблюдалось метилирование MGMT. В то же время в 67 % случаев с метилированием MGMT отсутствовали мутации IDH1 / 2, что указывает на существование других механизмов метилирования MGMT в глиомах. Данные свидетельствуют в пользу необходимости одновременного определения 2 биомаркеров при выборе послеоперационной терапии пациентов

Роль метилирования регуляторного района вируса папиллом человека типа 16 в экспрессии вирусных онкогенов Е6 и E7 в первичных опухолях шейки матки

Background. Overexpression of the human papillomavirus oncogenes E6 and E7 is a major factor in initiation and progression of HPV-induced tumors. Inactivation of negative regulatory function of E2 protein – the main viral transcription and replication regulator – is considered to be an important mechanism leading to the viral oncogenes overexpression. It is known that the loss of E2 functions occurs due to disruption of E2 open reading frame during the viral DNA integration into a cell genome in a part of HPV-positive tumors. An alternative mechanism of E2 function blocking in tumors retained its expression can be methylation of the HPV regulatory region, since it is known that E2 is incapable to bind its methylated binding sites.The study objective is to analyze methylation of the HPV16 regulatory region and expression of the viral E6 and E7 oncogenes in E2 expressing or non-expressing clinical samples of cervical cancer.Results. It has been demonstrated that the level of the HPV16 URR methylation in E2-expressing lesions is significantly higher than that in non-expressing cervical cancer lesions. Demethylation of the HPV16 promoter in cervical cell line Caski is followed by decrease of the viral E6 и E7 oncogenes mRNA levels, supporting the hypothesis that methylation is necessary for effective E6 and E7 transcription and indicates on restitution of E2 regulatory function in E2-expressing cervical cancer cells.Conclusion. These data suggest that methylation of E2 binding sites in HPV16 regulatory region blocking E2 protein binding represents an important mechanism ensuring high level of the viral E6 and E7 oncogenes expression.Введение. Высокий уровень экспрессии онкогенов E6 и E7 вирусов папиллом человека (human papillomaviruses, HPV) является основным фактором инициации и прогрессии HPV-индуцированных опухолей. Инактивация функции негативного регулятора вирусной транскрипции и репликации – вирусного белка E2 – считается основным механизмом, приводящим к повышению экспрессии вирусных онкогенов. Известно, что в части HPV-положительных опухолей утрата функций Е2 происходит вследствие разрыва открытой рамки считывания гена при интеграции вирусной ДНК в геном клетки. Установленная в опытах in vitro неспособность Е2 связываться со своими сайтами в случае их метилирования позволяет предположить, что метилирование регуляторной области HPV может быть альтернативным механизмом блокировки функций Е2 в опухолях, сохранивших его экспрессию.Цель исследования – анализ метилирования регуляторного района HPV 16-го типа и экспрессии вирусных онкогенов Е6 и E7 в клинических образцах рака шейки матки, экспрессирующих и неэкспрессирующих Е2.Результаты. Повышенный уровень метилирования регуляторного района, в том числе сайтов связывания Е2, наблюдается в опухолях, экспрессирующих Е2, по сравнению с опухолями, не экспрессирующими Е2 (р ≤0,0001). Снижение уровня метилирования промотора HPV 16-го типа в клеточной линии CaSki при обработке деметилирующим агентом сопровождается снижением уровня матричной РНК вирусных онкогенов E6 и E7, что подтверждает необходимость метилирования для эффективной транскрипции. Эти данные указывают на восстановление негативной регуляторной функции Е2, экспрессирующегося в этих клетках, при деметилировании промотора.Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что метилирование сайтов связывания E2 в регуляторной области HPV 16-го типа является важным механизмом, обеспечивающим высокий уровень экспрессии вирусных онкогенов E6 и E7 при сохранении экспрессии гена Е2

Hypermethylation of genomic 3.3-kb repeats is frequent event in HPV-positive cervical cancer

Background: Large-scale screening methods are widely used to reveal cancer-specific DNA methylation markers. We previously identified non-satellite 3.3-kb repeats associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) as hypermethylated in cervical cancer in genome-wide screening. To determine whether hypermethylation of 3.3-kb repeats is a tumor-specific event and to evaluate frequency of this event in tumors, we investigated the 3.3-kb repeat methylation status in human papilloma virus (HPV)-positive cervical tumors, cancer cell lines, and normal cervical tissues. Open reading frames encoding DUX family proteins are contained within some 3.3-kb repeat units. The DUX mRNA expression profile was also studied in these tissues. Methods: The methylation status of 3.3-kb repeats was evaluated by Southern blot hybridization and bisulfite genomic sequencing. The expression of DUX mRNA was analyzed by RT-PCR and specificity of PCR products was confirmed by sequencing analysis. Results: Hypermethylation of 3.3-kb repeats relative to normal tissues was revealed for the first time in more than 50% (18/34) of cervical tumors and in 4 HPV-positive cervical cancer cell lines. Hypermethylation of 3.3-kb repeats was observed in tumors concurrently with or independently of hypomethylation of classical satellite 2 sequences (Sat2) that were hypomethylated in 75% (15/20) of cervical tumors. We have revealed the presence of transcripts highly homologous to DUX4 and DUX10 genes in normal tissues and down-regulation of transcripts in 68% of tumors with and without 3.3-kb repeats hypermethylation. Conclusion: Our results demonstrate that hypermethylation rather than hypomethylation of 3.3-kb repeats is the predominant event in HPV-associated cervical cancer and provide new insight into the epigenetic changes of repetitive DNA elements in carcinogenesis

Идентификация нового сайта метилирования в промоторном районе гена Sept9 для диагностики гепатоцеллюлярной карциномы

Background. Over 600,000 people die from hepatocellular carcinoma (HCC) each year worldwide. The disease is often detected at advanced stages and in many cases is not curable. Early diagnostic and monitoring of HCC recurrences remains a substantial problem in clinical oncology. That determines the need for a search for highly sensitive and specific biomarkers for the non-invasive of HCC diagnostics. The objective of the study. Identification of the hypermethylated locus in the promoter region of the septin 9 (Sept9) gene based on the annotated methylomes from the public databases. Experimental validation of methylation on a pilot panel of paired clinical samples of patients with HCC, as well as tissue samples from patients with benign liver tumors and lymphocytes from healthy donors. Materials and methods. To analyze the methyl data, samples of HCC from TCGA, hepatocellular adenoma from GEO (Gene Expression Omnibus) depository, peripheral blood cells and tissues of healthy donors from Methbank were used. Experimental validation of methylation levels of the identified site was carried out on a pilot panel of clinical samples by bisulphite pyrosequencing using PyroMark Q24.Results. Based on the analysis of methylome data, we selected cg20275528 site, which is characterized by high level of methylation in HCC tissues and minimal levels of methylation in non-tumor liver tissue, hepatocellular adenoma and peripheral blood of healthy donors. Experimental testing on a pilot panel of clinical specimens showed that the level of marker site methylation in HCC (42 % median) is significantly higher than in non-tumor liver tissues (3 % median) and benign neoplasms (1.5 % median) and exceeds the threshold value in HCC compared to paired samples of adjacent non-tumor liver tissue in 20 out of 30 studied cases (66.6 %). The general possibility for cg20275528 methylation detection in circulating DNA of plasma in HCC patients was shown.Conclusion. The obtained results indicate that the approach to the detection and experimental verification of diagnostically significant markers developed and tested in this study can be used to identify new differentially methylated sites and to establish new approaches for non-invasive HCC diagnosis.Введение. Ежегодно во всем мире от гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) умирают более 600 тыс. человек. Заболевание часто выявляется на поздних стадиях и во многих случаях является некурабельным. Ранняя диагностика и мониторинг развития рецидивов ГЦК продолжают оставаться существенной проблемой клинической онкологии. Это определяет актуальность поиска высокочувствительных и специфичных биомаркеров для неинвазивной диагностики ГЦК. Цель исследования – идентификация гиперметилированного при ГЦК локуса в промоторном районе гена септин 9 (Sept9) на основании анализа общедоступных данных метиломных исследований; экспериментальная валидация метилирования на пилотной панели парных клинических образцов пациентов с ГЦК, а также образцов ткани пациентов с доброкачественными опухолями печени и лимфоцитов здоровых доноров.Материалы и методы. Для анализа метиломных данных были использованы выборки ГЦК TCGA, гепатоцеллюлярной аденомы из депозитария GEO (Gene Expression Omnibus), а также клеток периферической крови и тканей здоровых доноров Methbank. Экспериментальную валидацию уровней метилирования идентифицированного сайта проводили на пилотной выборке клинических образцов с использованием метода бисульфитного пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24.Результаты. На основании анализа метиломных данных нами был выбран сайт cg20275528, который характеризуется высоким уровнем метилирования в тканях ГЦК и минимальными уровнями метилирования в клетках неопухолевой ткани печени, гепатоцеллюлярной аденомы и периферической крови здоровых доноров. Экспериментальная проверка на пилотной выборке клинических образцов показала, что уровень метилирования маркерного сайта в ГЦК (медиана 42 %) значительно выше, чем в неопухолевых тканях печени (медиана 3 %) и доброкачественных новообразованиях (медиана 1,5 %) и превышает пороговое значение в ГЦК по сравнению с парными образцами прилежащей неопухолевой ткани печени в 20 (66,6 %) из 30 исследованных случаев. Показана принципиальная возможность детекции метилирования cg20275528 в циркулирующей ДНК плазмы больных ГЦК.Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что разработанный и апробированный в этой работе подход к поиску и экспериментальной верификации диагностически значимых маркеров может быть использован для выявления новых дифференциально метилированных сайтов и разработки новых подходов к неинвазивной диагностике ГЦК