Μεταβολίτες μυκήτων με ζιζανιοκτόνο δράση

About 10% of the existed 300,000 plant species are considered weeds. Since a number of 200 weed species can cause serious problems in cultivated plants, effective weed control is very important in crop protection. Today weed control is mainly based on chemicals, therefore the development of new herbicides is of great interest to those involved in crop protection. The discovery of new molecules with phytotoxic activity is made via chemical synthesis based on lead compounds. Although such compounds are obtained through laboratory synthesis, recently bioactive metabolites of organisms, for example of fungi, have been used as lead molecules for the development of new plant protection products. The majority of bioactive metabolites are products of secondary metabolism. Fungi constitute a potential source of bioactive substances because they produce secondary metabolites not only under natural conditions but also in culture media. In this study, six fungi were isolated from infected weeds and maintained on culture media. The isolates S1 and S2 were obtained from Sonchus oleraceus, 01 and 02 from Piptatherum miliaceum and the isolates L1 and L2 from Avena sterilis. The appropriate culture media for the in vitro culture of each of the aforementioned isolates were selected and the, in vitro, production of phytotoxic metabolites was examined. Preliminary testing showed the existence of phytotoxic agents crude preparations from cultures of S1, L1 and L2. Considering that crop fields are more often infested by wild oats than S. oleraceus, the research was further focused on the isolation and identification of phytotoxic metabolites from the fungus LI, isolated from A. sterilis. The isolate L1 was identified as a pathotype of Drechslera avenae. Pathogenesis testing revealed that it had host specificity to A. sterilis, while it was not pathogenic to any of the other monocot and dicot species tested, not even to Avena fatua and Avena sativa. The effect of temperature on mycelial growth and spore production of LI was also determined. Two phytotoxic metabolites which were isolated from cultures of the fungus and chemically characterized (NMR, GC-MS, FT-IR) are the macrodiolides (-)-pyrenophorol and (-)-pyrenophorin. The production of these secondary metabolites in culture was studied in relation to time and incubation temperature. The production of (-)-pyrenophorol reached a maximum in thirty five to forty days but the highest yield of pyrenophorin was obtained in ten days. Temperatures ranging from 15 to 20°C favoured the production of the metabolites. Phytotoxicity testing of the metabolites showed that pyrenophorol was phytotoxic to A. sterilis and A. fatua, causing leaf and stem necroses but also the “green island” effect on the leaves. Symptoms of phytotoxicity were also caused by pyrenophorol in young seedlings of Lycopersicon esculentum. In addition, red discoloration was observed at the contact point of the tissues of Sorghum halepense and the metabolite. The phytotoxicity of pyrenophorol was restricted to the above ground parts of the susceptible plants, whereas it had no effect on seed germination or on the development of the root system. The metabolite did not cause symptoms of phytotoxicity to any of 34 plant species tested. Pyrenophorin which only differs structurally from pyrenophorol only at the substituents of C5 and C13, didn’t show any selectivity, being phytotoxic to all monocot and dicot plants tested. As opposed to pyrenophorol, pyrenophorin affected both above and underground plant parts (“green island” effect, seed germination and root system development). The macrodiolides (-)-pyrenophorol and (-)-pyrenophorin can be used as lead compounds for the development of new wild oats herbicides because they not only exhibit significant phytotoxic activity to A. sterilis and A. fatua but they also differ chemically from the herbicides used in practice for wild oats control, for which cases of resistance have been reported.Ανάμεσα στα περίπου 300.000 είδη των ανώτερων φυτών το 10% είναι ζιζάνια. Από αυτά περίπου διακόσια είδη είναι υπεύθυνα για το 95% των προβλημάτων που προκαλούνται στις καλλιέργειες. Η αποτελεσματική αντιμετώπιση των ζιζανίων αποτελεί σημαντικό παράγοντα επιτυχίας μίας καλλιέργειας και βασίζεται σχεδόν αποκλειστικά στη χρήση χημικών ουσιών (ζιζανιοκτόνων). Έτσι η ανάπτυξη νέων ζιζανιοκτόνων είναι σημαντική για τη φυτοπροστασία και όσους ασχολούνται με διάφορους τομείς στο πεδίο αυτό. Η ανακάλυψη νέων χημικών μορίων με φυτοτοξική δράση γίνεται κυρίως μέσω χημικής σύνθεσης που βασίζεται σε χημικά πρότυπα. Η προέλευση αυτών των προτύπων είναι, κατά κύριο λόγο, η σύνθεση στο εργαστήριο, αλλά τα τελευταία χρόνια ως χημικά πρότυπα για την ανάπτυξη νέων φυτοπροστατευτικών προϊόντων χρησιμοποιούνται ενώσεις που είναι βιοδραστικοί μεταβολίτες οργανισμών, όπως για παράδειγμα μυκήτων. Κατά κανόνα, οι μεταβολίτες που παρουσιάζουν βιοδραστικότητα είναι προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού. Επειδή οι μύκητες παράγουν δευτερογενείς μεταβολίτες όχι μόνο σε φυσικές συνθήκες αλλά και σε καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό, τελευταία αποτελούν αξιόλογο αντικείμενο έρευνας για την απομόνωση ενώσεων με ενδιαφέρουσα βιοδραστικότητα. Στην παρούσα μελέτη, από προσβεβλημένα ζιζάνια απομονώθηκαν, σε θρεπτικό υλικό, οι μύκητες που ήταν υπεύθυνοι για τις προσβολές. Συνολικά απομονώθηκαν έξι μύκητες, δύο από το Sonchus oleraceus (S1 και S2), δύο από το Piptatherum miliaceum (Ο1 και Ο2) και δύο από το Avena sterilis (L1 και L2). Αφού εντοπίστηκαν τα κατάλληλα θρεπτικά υλικά για την in vitro καλλιέργεια του καθενός, ελέγχθηκε η παραγωγή φυτοτοξικών στους ξενιστές τους μεταβολιτών. Από τον προκαταρκτικό έλεγχος διαπιστώθηκε η παραγωγή φυτοτοξινών σε καλλιέργεια από τους S1, L1 και L2. Εκτιμώντας ότι η αγριοβρώμη δημιουργεί σοβαρότερα προβλήματα στις διάφορες καλλιέργειες και είναι πιο δυσεξόντωτο ζιζάνιο από το ζοχό, εστιάσαμε την έρευνά μας στην απομόνωση και ταυτοποίηση φυτοτοξικών μεταβολιτών από το μύκητα L1 που ήταν παθογόνος του A. sterilis. Αφού εντοπίστηκε η πιθανή παραγωγή φυτοτοξινών από τον L1, ο μύκητας ταυτοποιήθηκε και διαπιστώθηκε ότι πρόκειται για στέλεχος του μύκητα Drechslern avenae. Από τις δοκιμές παθογένεσης που έγιναν διαπιστώσαμε ότι το στέλεχος αυτό ήταν εξειδικευμένο παθογόνο για το Α. sterilis, ενώ δεν ήταν παθογόνο σε κανένα από τα υπόλοιπα αγρωστώδη και πλατύφυλλα είδη στα οποία δοκιμάστηκε, ούτε καν στα Avena fatua και Avena sativa. Για το στέλεχος αυτό μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη και στην παραγωγή των καρποφοριών του. Από καλλιέργειες του μύκητα σε θρεπτικό υλικό απομονώθηκαν δύο φυτοτοξικοί μεταβολίτες και ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπικές μεθόδους (NMR, GC-MS, FT-IR). Ανήκουν στα μακροδιολίδια και έχουν τα συμβατικά ονόματα (-)-pyrenophorol και (-)- pyrenophorin. Μελετήθηκε η παραγωγή των δευτερογενών αυτών μεταβολιτών από το μύκητα σε καλλιέργεια, σε σχέση με το χρόνο και τη θερμοκρασία επώασης. Η παραγωγή της pyrenophorol να φτάνει στο μέγιστο σημείο της τριανταπέντε με σαράντα ημέρες ενώ της pyrenophorin δέκα ημέρες από την έναρξη της επώασης του μύκητα σε στερεό θρεπτικό υλικό. Η παραγωγή και των δύο μεταβολιτών ευνοήθηκε σε θερμοκρασίες επώασης των καλλιεργειών από 15 ως 20°C. Κατόπιν μελετήθηκε η φυτοτοξικότητα των μεταβολιτών. Η pyrenophorol ήταν εκλεκτικά φυτοτοξική στα είδη της αγριοβρώμης A. sterilis και A. fatua, προκαλώντας συμπτώματα όπως νεκρώσεις φύλλων και στελεχών και σχηματισμό έντονα πράσινων νησίδων στα φύλλα (green islands). Συμπτώματα φυτοτοξικότητας προκάλεσε, επίσης, σε νεαρά σπορόφυτα Lycopersicon esculentum ενώ και στο Sorghum halepense δημιούργησε κόκκινο μεταχρωματισμό στα σημεία επαφής των ιστών με το μεταβολίτη. Η φυτοτοξικότητα της pyrenophorol περιορίστηκε στα υπέργεια τμήματα των φυτών, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στη βλάστηση των σπόρων ή στην ανάπτυξη του ριζικού συστήματος. Σε κανένα άλλο από τα 34 αυτοφυή και καλλιεργούμενα φυτά στα οποία δοκιμάστηκε ο μεταβολίτης δεν προκάλεσε κάποιο σύμπτωμα φυτοτοξικότητας. Αν και τα μόρια των δύο μεταβολιτών παραλλάσσουν μόνο στους υποκαταστάτες στις θέσεις C-5 και C-13, η έκφραση της φυτοτοξικότητας της pyrenophorin διέφερε σημαντικά από αυτήν της pyrenophorol. Η pyrenophorin, εν αντιθέσει με την pyrenophorol, δεν έδειξε εκλεκτικότητα καθώς ήταν φυτοτοξική σε όλα τα φυτά, μονοκότυλα και δικότυλα, στα οποία δοκιμάστηκε. Ακόμη, είχε επίδραση και σε υπέργεια και σε υπόγεια μέρη των φυτών, καθώς επηρέασε τη βλαστικότητα των σπόρων, την ανάπτυξη του ριζικού συστήματος και προκάλεσε τη δημιουργία “green islands” στα φύλλα. Τα μακροδιολίδια (-)-pyrenophorol και (-)-pyrenophorin επειδή διαφέρουν χημικά από τα χρησιμοποιούμενα στην πράξη ζιζανιοκτόνα για την καταπολέμηση της αγριοβρώμης για τα οποία έχουν καταγραφεί περιπτώσεις ανθεκτικότητας και έχοντας αξιόλογη φυτοτοξική δράση στο A. sterilis κυρίως και στο A. fatua συγκεντρώνουν 8 ενδιαφέρουσες ιδιότητες για να αποτελέσουν πρότυπα για την ανάπτυξη νέων ζιζανιοκτόνων για την αντιμετώπιση της αγριοβρώμης