Avaliação da interação de proteínas e antinutrientes e o seu efeito na digestibilidade in vitro e geleificação de proteínas

Orientadora: Dra Luciana Igarashi MafraCoorientador: Dr. Marcos Rogério MafraTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. Defesa: Curitiba, 20/02/2019Inclui referências: p.132-152Resumo: Alguns alimentos, principalmente as sementes de leguminosas, possuem antinutrientes (AN) capazes de diminuir o seu valor nutritivo. Os ANs mais conhecidos por formarem complexos com proteínas são os taninos, as saponinas e os fitatos. Esses ANs podem influenciar a digestão proteica, atividade enzimática e propriedades funcionais das proteínas. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar as interações de proteínas e ANs e a sua relação com a digestibilidade proteica in vitro (DPIV) e geleificação de proteínas. Os estudos de interação molecular foram realizados por calorimetria de titulação isotérmica e a capacidade geleificante foi determinada utilizando reologia oscilatória. Foi observado que as interações do ácido fítico (AF) com a albumina do soro bovino (BSA) ocorrem principalmente por interações eletrostáticas e são favorecidas pelo aumento da temperatura e baixa força iônica. Na presença de cátions divalentes (Mg2+, Ca2+ e Mn2+), o AF forma um complexo ternário com a BSA, o qual interfere na solubilidade da proteína, mas não afeta a sua DPIV. As interações entre o ácido tânico (AT) e BSA ocorrem em diversos sítios da proteína por ligações hidrofílicas e hidrofóbicas. Estas interações tornam-se menos favoráveis com o aquecimento e mais favoráveis com o aumento da força iônica. O AT diminui a DPIV drasticamente (em até 100% dependendo da razão mássica de AT/BSA), sendo que os cátions divalentes agravam o efeito negativo do AT na DPIV. As interações entre a saponina da casca de Quillaja (SCQ) e BSA não afetarem a DPIV em baixas razões mássicas de SCQ/BSA. Além disso, a SCQ melhorou a capacidade geleificante da BSA. As interações moleculares da proteína com misturas de ANs mostraram que o AF aumenta a afinidade entre o AT e BSA e que a SCQ aumenta a complexidade das ligações nos sistemas contendo AT, SCQ e BSA. As misturas de ANs influenciaram a DPIV sendo observado um efeito sinérgico quando mais de um AN estava presente, provavelmente devido a interações complexas envolvendo enzimas digestivas, interações AN-AN, competição, entre outros. Os ANs AF e AT promoveram alterações na estrutura secundária das proteínas, diminuindo a porcentagem de a-hélice, além de diminuírem a solubilidade proteica. Por outro lado, a SCQ não promoveu alterações na estrutura secundária e solubilidade da proteína. Os ANs alteraram a geleificação de isolados proteicos comerciais de maneira diferente para cada proteína (soja, ervilha ou arroz). Isso ocorre devido às interações destes com as cadeias polipeptídicas da proteína, o que afeta a sua solubilidade e estabilidade e, dessa forma, a sua organização durante a geleificação. Os ANs estão comumente presentes nos alimentos e podem impactar de maneira significativa no comportamento das proteínas, tanto no alimento quanto em organismos vivos, e este impacto pode ser minimizado ou maximizado dependendo das condições do meio (temperatura, força iônica, presença de cátions divalentes e razão mássica dos componentes). O entendimento das interações envolvendo os ANs se torna essencial para o processamento e melhor aproveitamento de alimentos que podem ser ricos nessas substânciasAbstract: Some foods, especially legume seeds, have antinutrient (AN) capable of decreasing their nutritional value. The ANs most known to form complexes with proteins are tannins, saponins and phytates. These ANs can influence protein digestion, enzymatic activity and functional properties of proteins. Thus, the aim of this work was to evaluate the interactions of proteins and ANs and their influence on in vitro protein digestibility (IVPD) and protein gelation. Molecular interaction studies were performed by isothermal titration calorimetry and the gelation capacity was determined using oscillatory rheology. Results showed that the interactions of phytic acid (PA) with bovine serum albumin (BSA) occur mainly by electrostatic forces and are favored by heating and low ionic strength. In the presence of divalent cations (Mg2+, Ca2+ and Mn2+), the PA forms a ternary complex with BSA, which interferes with the solubility of the protein but does not affect its IVPD. The interactions between tannic acid (TA) and BSA occur at several sites of the protein by hydrophilic and hydrophobic bonds. These interactions become less favorable with heating and more favorable with increasing ionic strength. TA decreases IVPD dramatically (up to 100% depending on the TA/BSA mass ratio), and the divalent salts aggravate the negative effect of TA on IVPD. The interactions between Quillaja bark saponin (QBS) and BSA did not affect IVPD at low QBS/BSA mass ratios. Besides, the QBS increased the gelation ability of the BSA. Molecular interactions of the protein with mixtures of ANs showed that PA increases the affinity between TA and BSA and that QBS increases the complexity of the binding in systems containing TA, QBS and BSA. Mixtures of ANs influenced IVPD and a synergistic effect was observed when more than one AN was present, probably due to complex interactions involving digestive enzymes, AN-AN interactions, competition, among others. The antinutrients PA and TA changed the protein secondary structure, decreasing the a-helix percentage, in addition to decreasing the protein solubility. On the other hand, QBS does not promote changes in protein secondary structure and solubility. The ANs altered the gelation of commercial protein isolates differently for each protein (soy, pea or rice). This is due to the interactions of ANs with the polypeptide chains of the proteins which affects protein solubility and stability and, thus, its organization during the gel formation. The ANs are commonly present in foods and can significantly impact the behavior of proteins both in food and in living organisms and this impact can be minimized or maximized depending on the conditions of the medium (temperature, ionic strength, presence of divalent cations and mass ratio components). Understanding the interactions involving ANs becomes essential for the processing and better utilization of foods that may be rich in these substancesResumo: Vários estudos têm demonstrado os efeitos imunomoduladores e antitumorais de pectinas, com destaque para as pectinas modificadas (MP), cuja atividade biológica e favorecida pela modificação estrutural. A pectina extraída de Brassica oleracea var. italica (FB) apresenta baixo peso molecular e galactose como o principal acucar neutro, características que podem torna-la mais facilmente absorvida pelo sistema gastrointestinal, acessando assim a circulação sanguínea e levando a respostas biomoduladoras. No presente estudo, FB foi avaliada quanto a sua atividade imunomoduladora e citotóxica para células de hepatocarcinoma humano (HepG2). FB (750 yg/ml) reduziu a viabilidade de macrófagos peritoneais de camundongos em ~28% com 48h de incubação. A atividade fagocítica destas células apos incubação por 48h com FB (500 yg/ml) aumentou em 30% e 35% nos ensaios com leveduras e com vermelho neutro, respectivamente. O número de macrófagos ativados avaliados por analise morfológica apos incubação com FB 250 yg/ml e 500 yg/ml aumentou em 40% e 68%, respectivamente. Adicionalmente, aumento de 120% no numero de macrófagos peritoneais ativados foi observado em camundongos apos 5 dias de administração oral (200 mg/kg) da pectina. FB (200 mg/kg) injetada na cavidade peritoneal induziu o recrutamento de celulas para este local apos 24 horas, alcançando ~490% e um aumento de 251% no numero destas células com perfil ativado em relação ao controle. No sobrenadante de macrófagos de animais (normais) incubados durante 48 h com FB (250 e 500yg/ml) e no fluido peritoneal de camundongos tratados com a pectina (200 mg/kg por 5 dias) nao houve aumento na produção de oxido nítrico e interleucinas IL-1B e IL-12 em relação ao controle, avaliados pelos métodos de Griess e ELISA, respectivamente. Entretanto, apos tratamento in vivo, houve aumento na producao de IL-10 por estas células. A proliferação de linfócitos totais isolados de baço de camundongos tratados oralmente com FB (200mg/kg) por 5 dias chegou a 51% em relação ao controle sem tratamento. Ao serem plaqueados e incubados com concanavalina A (ConA) por 72h, houve um aumento de 24,4% no numero de células em relação ao controle. O sobrenadante da cultura de linfócito de camundongos tratados oralmente com FB estimulou a proliferação de células da medula óssea, representando um aumento de 46,1% no numero de células em comparação com o grupo controle. Este resultado indica que FB foi capaz de promover proliferação celular mediada por linfócitos. Adicionalmente, FB reduziu a viabilidade de células HepG2 apos incubação com diferentes concentracoes por 48 e 72 horas. Ensaio preliminar para apoptose mostrou que incubacao de HepG2 com FB a 250 e 500 yg/ml por 48 horas resultou em aumento na proporcao de celulas fixadas com anexina V e PI em comparacao com os controles nao tratados. Estes resultados sugerem que FB administrada oralmente pode levar a respostas antiinflamatorias e antitumorais.Abstract: Many studies have been reported the immunomodulatory and antitumor effects of pectins, highlighting modified pectins (MPs), whose biological activity is favored by structural modification. Pectin extracted from Brassica oleracea var. italica (FB) presents low molecular mass and galactose as the main neutral sugar, which could be more easily absorbed by the microfold cells in the gastrointestinal tract, access the blood and trigger biomodulatory responses. In the present study, FB was evaluated for its immunomodulatory activity and cytotoxicity to hepatocellular carcinoma cells (HepG2). FB (750 yg/ml) reduced the viability of peritoneal macrophages of mice by ~28% after 48h of incubation. In the same conditions, FB (500 yg/ml) increased the phagocytic activity of macrophages by 30% e 35% in the assays with yeast as phagocytic particles and neutral red, respectively. Morphological analysis revealed an increase of 40% and 68% in the number of activated macrophages in the presence of FB 250 yg/ml and 500 yg/ml, respectively. FB (200 mg/kg) by oral administration enhanced 120% the number of activated macrophages after 5 days of treatment. When the same dose was injected intraperitoneally, an increase of 490% in the peritoneum cell number was observed. The analysis of these cells revealed an increase of 251% in the number of cells with activated profile, in respect to control. In the supernatant of macrophages from normal mice incubated with FB (250 and 500yg/ml) for 48h, and in the peritoneal fluid from mice after treatment with FB (200mg/kg), no alterations were detected in the nitric oxide and interleukins (IL-1B and IL- 12) production, in respect to control. However, after in vivo treatment, an increase in IL-10 production by these cells was observed. The proliferation of spleen lymphocytes from mice orally treated with FB (200mg/kg) for 5 days reached 51% in respect to control. These cells were then plated in the presence of concanavalin A for 72 h, and an increase of 24,4% in the cell number was observed. The supernatant of lymphocytes from mice orally treated with FB (200mg/kg) promoted the proliferation of bone marrow cells, representing an increase of 46.1% in respect to control (untreated). This result suggests that FB was able to stimulate the lymphocyte-mediated bone marrow cell proliferation. A preliminary assay for apoptosis showed that HepG2 cells incubated with FB at 250 and 500 yg/ml for 48 h had an increase in the proportion of annexin V/PI-staining cells in comparison with untreated controls. These findings showed that oral administration of FB might trigger anti-inflammatory and antitumoral responses