Mikroszómális glukóz-6-foszfát szerepe granulocita apoptózisában = Apoptotic role of microsomal glucose-6-phosphate in granulocytes

Az endoplazmás retikulum glukóz-6-foszfát transzporterére specifikus poliklonális antitestet termeltettünk, amely patkány és humán glukóz-6-foszfát transzportert ismer fel. Western blottal és immunhisztomkémiai módszerekkel közvetlenül bizonyítottuk a transzporter jelenlétét humán májból, patkány májból és veséből származó mikroszómákban; humán granulocitákban, patkány agyban és harántcsíkolt izomszövetben. Kimutattuk, hogy humán granulociták és differenciálódott HL60-as sejtekben megtalálható a hexóz-6-foszfát dehidrogenáz, amelynek a működése függ a glukóz-6-foszfáttól, aktív centruma az endoplazmás retikulum lumenében található és NADPH-t generál. A keletkezett 6-foszfoglukonátot a granulocita mikroszómák nem metabolizálják tovább. mRNS és fehérje szinten kimutattuk 1-es típusú 11-béta-hidroxiszteriod dehidrogenáz jelenlétét granulociták mikroszómáiban. Az enzim granulocitákban is oxidoreduktázként működik, működéséhez intraluminális NADPH(NADP)-t használ fel. Az enzim NADPH-t generáló kortizol dehidrogenáz aktivitásával kivédtük a glukóz-6-foszfát transzport gátlásával létrehozott apoptózist. Eredményeink szerint a májhoz hasonlóan humán granulocitákban is megtalálható a glukóz-6-foszfát - hexóz-6-foszfát és 11-béta-hidroxiszeriod dehidrogenáz 1 funkcionális egysége. | We employed antibodies raised against the liver glucose-6-phoshphate transporter protein. With different immunodetection methods, we have shown that the protein is expressed in endoplasmic reticulum membranes derived from human and rat liver and rat kidney. The expression was also present in the following tissues: human granulocytes, rat brain and skeletal muscle. We have demonstrated the expression of hexose-6-phosphate dehydrogenase in human neutrophils and mature HL60-cells. Its catalytic subunit is intraluminal and activity of the enzyme was shown to be dependent on glucose-6-phosphate and produces NADPH. 6-phosphogluconate formed in this reaction was not metabolized further. The expression and activity of 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1, another NADP(H)-dependent microsomal enzyme were also detected in human neutrophils. The NADPH-generating cortisol dehydrogenase activity of the enzyme prevented neutrophil apoptosis provoked by the inhibition of the glucose-6-phosphate transporter. The results show that granulocytes are equipped with a functional glucose-6-phosphate- hexose-6-phosphate dehydrogenase-11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 system

Pro- és antioxidáns hatások szerepe az endoplazmás retikulum eredetű stresszben és apoptózisban = Role of pro- and antioxidant effects in the endoplasmic reticulum stress and apoptosis

Az endoplazmás retikulum számos környezeti és metabolikus hatás szenzora. A jelátvitel gyakran a luminális redoxon keresztül valósul meg. Munkánk során azonosítottuk a hexóz-6-foszfát dehidrogenázt, mint a luminális piridin nukleotidok redox státuszának meghatározóját több sejttípusban. A luminális redox fontos a tápláltság érzékelésében, valamint a sejt apotózis/autofágia szabályozásában. A luminális redoxot befolyásoló antioxidánsok, hepatotoxinok, hormonanalógok és más környezeti hatások alapvetően befolyásolhatják a sejt életképességét. | The endoplasmic reticulum is an important sensor and integrator of environmental and metabolic stimuli. The signaling often involves the changes in luminal redox. We have identified the hexose-6-phosphate dehydrogenase as the main determinant of the redox state of luminal pyridine nucleotides in several cell types. Luminal redox is important in nutrient sensing, and in the regulation of programmed cell death. Antioxidants, hepatotoxins, endocrine disruptors and other environmental agents affecting luminal redox can profoundly alter the viability of the cell

Antioxidáns anyagcsere és transzportfolyamatok az endo/szarkoplazmás retikulumban. = Antioxidant metabolism and transport processes in the endo/sarcoplasmic reticulum.

Kimutattuk, hogy a glutation-transzport sebessége jól korrelál a rianodin receptor kalcium csatorna (RyR) egyik izoformája, a RyR1 mennyiségével. Különböző RyR gátlószerek hatékonyan gátolták, RyR agonisták pedig aktiválták a transzportot. Összehasonlítottuk a glutation transzport sajátosságait RyR1 csatornát expresszáló transzfektált, illetve vad típusú HEK293 sejtekből izolált mikroszómákon. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a RyR1 közvetlenül vesz részt a glutation transzportjában. Megállapítottuk továbbá, hogy a RyR1 csatorna magas intraluminális glutation szint esetén rezisztenssé válik egyes gátlószereivel szemben. Kimutattuk, hogy az ER lumenben elhelyezkedő hexóz-6-foszfát dehidrogenáz fenntartja a lokális redukált NADPH szintet. Igazoltuk, hogy a glutation reduktáz enzim, amely a sejt egyéb részein a tiol/diszulfid és a piridin nukleotid redox rendszerek közötti kapcsolatot biztosítja, nincs jelen az ER lumenben. Skorbutizált tengerimalacok májában a skorbut kialkulásával párhuzamosan az ER stressz jeleit és fokozott apoptózist észleltük. A kimutatott ER-stressz és apoptózis alátámasztja az aszkorbát szerepét a fehérje-foldingban. Kidolgoztunk egy új módszert, amely lehetővé teszi jelöletlen molekulák mikroszómális transzportjának tanulmányozását. Az új módszer több vegyület egyidejű transzportjának mérésére és a ligand stabilitásának nyomonkövetésére is alkalmas, érzékenysége hasonló a radioaktív detektáláséhoz, viszont gazdaságosabb annál. | We found a correlation between the rate of glutathione transport and the abundance of an isoform of ryanodine receptor calcium channel (RyR1). The transport was inhibited or activated by various RyR antagonists or agonists, respectively. The characteristics of glutathione transport were compared in microsomes prepared from RyR1 expressing transfected and wild type HEK293 cells. Our results prove the direct involvement of RyR1 in glutathione transport. In addition, we found that RyR1 channel becomes resistant to some of its inhibitors at high luminal glutathione levels. We observed that hexose 6-phosphate dehydrogenase maintains the reduced NADPH pool in the ER lumen. We proved that glutathione reductase - that couples the thiol/disulfide and pyridine nucleotide redox systems in other cellular compartments - is not present in the ER. We detected the indicators of ER stress and enhanced apoptosis in the liver of scorbutic guinea pigs. These findings further support the hypothesis that ascorbate participates in the process of protein folding in the ER. We developed a new method that allows the investigation of the microsomal transport of unlabeled compounds. The novel technique is suitable for the detection of simultaneous multiple transport processes and for the monitoring of the ligand stability. Its sensitivity is similar to that of the transport measurements based on radiodetection

Elektron transzfer rendszerek élettani szerepe = The physiological role of electron transfer systems

Fagocitákban leírtuk a NADPH oxidázt szabályozó két különböző GTPáz aktiváló fehérje szabályozását és a kísérő K+ transzport baktérium ölő hatását. Agyi mitokondriumokban (mito) a légzési lánc I. komplexének szubsztrátjai membránpotenciál (Em) függően reaktív oxigénszármazékot (ROS) képeznek. Az alfa-glicerofoszfát (aGP) ROS-t képez az I. komplexen és az aGP-dehidrogenáz enzimen, utóbbit a Ca2+ aktivája. Idegvégződésekben a mito ROS képzését az Em nem befolyásolja. A mito-k elektromos szincíciumot képeznek, de a Ca2+ diffúziója korlátozott. Alacsony O2.- szint a Ca2+ -mobilizáló agonista Ca2+ jel képző hatását glomerulóza sejtben gátolja. A ROS támadáspontja a belső raktárból történő Ca2+ felszabadulás. UV hatására a mito Ca2+ felvétele is csökkent. Angiotenzin II -vel ingerelt H295R sejtben a mito Ca2+ jel képzés sebessége a mito és az endoplazmás retikulum (ER) közelségével korrelál. A p38 MAPK és az újtípusú PKC izoformák egyidejű gátlása a Ca2+ jelnek a citoszolból a mito-ba történő áttevődését gátolja és a fenti korrelációt megszünteti. Az ER lumenében a tiol/diszulfid rendszertől elkülönülő NAD(P)+/NAD(P)H rendszer működik. Redox állapotát a glukóz-6-foszfát transzporter és az intraluminális oxidoreduktázok határozzák meg. A redukált állapot fenntartása szükséges a glukokortikoidok prereceptoriális aktiválásához, s egyes sejtekben antiapoptotikus hatású. Jellemeztük az ER szulfát transzporterét, valamint a transzlokon peptid csatorna anion permeabilitását. | We described in phagocytes the regulation of two GTPase activating proteins, terminating the activity of plasmalemmal NADPH oxidase and the role of K+ movements in bacterial killing. In brain mitochondria complex I dependent substrates show a membrane potential (Em) dependent reactive oxygen species (ROS) formation. ROS production by alpha-glycerophosphate (aGP) occured at complex I and on the aGP-dehydrogenase enzyme. The latter is activited by Ca2+. Mitochondria form an electric syntitium but the diffusion of Ca2+ is limited. In glomerulosa cells, at low [O2.-] angiotensin-induced Ca2+ signalling is attenuated, the site of ROS action is Ca2+ release from the internal stores. The rate of mitochondrial Ca2+ uptake in angiotensin-stimulated cells correlates with the vicinity of the mitochondrion and the endoplasmic reticulum (ER). Simultaneous activation of p38 MAPK and the novel isoforms of PKC attenuates the transfer of cytosolic Ca2+ signal into the mitochondria and abolishes this correlation. In the ER we observed a novel NAD(P)+/NAD(P)H system different from the thiol/disulphide system. Its reduced state is tuned by the glucose-6-phosphate transporter and the luminal oxidoreductases and is required for the prereceptorial activation of glucocorticoids. We have characterized the sulphate transport in the ER, and the contribution of the translocon peptide channel to the membrane permeation of small anions