Évaluation de l’impact de l’extrapolation de bioréacteur sur la physiologie de Yarrowia lipolytica pour la production de lipase

Les travaux entrepris au cours de cette thèse visent à mettre en place une méthodologie globale d’extrapolation de bioréacteurs. Le procédé de production de lipase par Yarrowia lipolytica a été plus particulièrement investigué, compte tenu de la complexité du système biologique et des paramètres physico-chimiques mis en œuvre. En effet, ce procédé met en œuvre une levure dite non conventionnelle dans un réacteur multiphasique G-L-L comprenant un substrat hydrophobe (le méthyloléate étant utilisé comme source de carbone renouvelable). Du fait du caractère strictement aérobie de ce type de levure, le transfert d’oxygène est un paramètre critique pour ce procédé. Dans un premier temps, l’ensemble des paramètres physico-chimiques clés du procédé ont été investigués (c’est-à-dire la dispersion du méthyloléate, les fluctuations en oxygène dissous et en pH). Cette évaluation a été menée en se basant sur des paramètres physico-chimiques (mélange du réacteur, transfert d’oxygène,…), mais également sur base de paramètres biologiques (synthèse et excrétion de la lipase, activation du gène lip2,…). Cette première étude a démontré que le paramètre critique était la fluctuation de l’oxygène dissous, ce paramètre menant à une réduction du rendement spécifique en lipase, liée à une atténuation de l’activité du gène lip2 codant pour la lipase extracellulaire de Y. lipolytica. Ce paramètre est d’autant plus important que les amplitudes des fluctuations en oxygène dissous sont amplifiées lors du processus de montée en échelle pour l’extrapolation du procédé. L’efficacité de dispersion du substrat hydrophobe (méthyloléate) au sein du milieu aqueux ne semble pas avoir d’impact sur l’efficacité du procédé, la levure sécrétant un biosurfactant permettant de stabiliser la dispersion. Les fluctuations en pH ont également peu d’impact sur le rendement de production de lipase, mais des observations au microscope ont révélé un début de dimorphisme cellulaire. Cette observation démontre la complexité de la réponse du système biologique face aux conditions de procédé. L’impact des fluctuations en oxygène dissous sur l’activité du gène lip2 a été confirmé par des analyses plus poussées en PCR quantitative (RT-qPCR). La deuxième partie du travail a donc été focalisée sur l’optimisation du transfert d’oxygène. Cette optimisation n’est pas triviale si on considère le phénomène de formation de mousse important lorsque la dispersion G-L au sein du réacteur est trop fine. Deux stratégies antimousse ont donc été envisagées : l’une mettant en œuvre l’ajout d’antimousse chimique et l’autre l’emploi d’un briseur de mousse mécanique. Cette dernière méthode s’est révélée inefficace du fait de la formation d’une couche de mousse persistante entre la surface du liquide et la turbine du briseur de mousse. Des analyses en cytométrie en flux ont permis d’observer un phénomène de dimorphisme qui semble lié au passage des cellules microbiennes au travers de cette couche de mousse, ce qui diminue le rendement en lipase. L’ajout d’antimousse chimique a donc été retenu et le transfert d’oxygène a pu être optimisé en fonction de contraintes de formation de mousse en considérant un enrichissement progressif de l’air d’entrée en oxygène pur. La dernière partie du travail a consisté à estimer l’extrapolation du procédé en prenant en compte à la fois les contraintes physico-chimiques du système (optimisation du transfert d’oxygène et limitation de la formation de mousse), ainsi que les contraintes biologiques. Cette extrapolation a tout d’abord été estimée au niveau de réacteurs scale-down permettant de reproduire les défauts d’écoulement généralement rencontrés au niveau industriel. De manière surprenante, cette étude a démontré que suite à l’adaptation physiologique des micro-organismes aux conditions d’écoulement, les problèmes de formation de mousse étaient de moins en moins marqués au cours de la montée en échelle du procédé. Cette observation va à l’encontre des calculs du génie chimique qui prédisent une augmentation du volume de mousse généré suite à la montée en volume des bioréacteurs et a été validée au niveau d’un bioréacteur pilote de 500L. Cela nous mène à conclure que la présence d’hétérogénéités au sein du volume réactionnel ne doit pas forcément être considérée comme un facteur négatif et pourrait au contraire être exploitée afin d’améliorer les performances des procédés et le design des bioréacteurs

Utilisation d’un bio-réacteur scale-down pour la production de lipase à partir de Yarrowia lipolytica

Les résultats obtenus au niveau de fermenteur de laboratoire et de volume industriel sont souvent différents à cause de la diminution de l’efficacité d’homogénéisation (substrats, oxygène dissous …etc.) du réacteur lorsque le volume augmente tels que. Dans cette optique, le fermenteur scale-down peut être utilisé. Il s’agit d’un système permettant de représenter à petite échelle les conditions de mélange des réacteurs de taille industrielle. Les lipases microbiennes sont stables dans de nombreux solvants organiques et ne requièrent pas de co-facteur pour être actives. Leurs domaines d'application sont très vastes et variés. Pour la production de la lipase, la levure non conventionnelle présente de nombreuses potentialités. A ce propos, Yarrowia lipolytica est le microorganisme le plus important vu qu’il produit les lipases à l’échelle industrielle. Pour des raisons économiques, les conditions de culture (pH, dispersion liquide-liquide, aération, …etc.) lors de la production de la lipase, doivent être optimalisées. Ce poster présente les résultats de l’effet de l’extrapolation sur la production de lipase à partir de Yarrowia lipolytica en mode batch avec un milieu de production optimisé (Destain et al., 2005). Les effets de la concentration en oxygène dissous, la dispersion liquide-liquide et les gradients de pH, qui sont affectés par le mélange du milieu de culture, sont présentés dans ce poster. Dans cette optique, plusieurs dispositifs scale-down ont été utilisés. Ceux-ci permettent de reproduire à l’échelle du laboratoire les hétérogénéités rencontrées à l’échelle industrielle

L'extrapolation des bioréacteurs : un problème de génie des procédés ou de physiologie microbienne ?

Bioreactor scale-up often pose a serious issue during the industrial development of a bioprocess considering the numerous physical and biological phenomena occurring in the reacting volume. The basic principles of scale-up coming from the traditional chemical and process engineering approaches will be first reviewed and will be then compared to a new one involving recent development at the level of microbial strain manipulation. This "physiological" approach of scale-up involves directly a biological component of the system (by comparison with the traditional approach for scaling-up involving physical parameters indirectly linked to the physiological phenomena occurring in the bioreactor), i.e. the synthesis of a reporter fluorescent protein when microbial cells are exposed to stress. It will be shown how this principle can be used for a better understanding of the relationship between bioreactor hydrodynamics and microbial stress

Impact of scaled-down dissolved oxygen fluctuations at different levels of the lipase synthesis pathway of Yarrowia lipolytica

The impact of the fluctuations in dissolved oxygen tension (DOT) on the lipase production by Yarrowia lipolytica has been investigated in a scale-down reactor (SDR). This bioreactor comprises a 20 l agitated vessel with an automatic valve controlling the opening and closure of the air flow line. This kind of scale-down apparatus is used in order to generate DOT gradients encountered in large-scale, while maintaining the other environmental conditions constant. The impact of DOT fluctuations has been estimated at three levels of the lipase synthesis machinery: lipase gene expression, lipase translation, lipase excretion to the extracellular medium. Among these levels, the performance of lipase production under oscillating DOT was significantly affected at the lipase gene expression level

New filamentous mutant of Yarrowia lipolytica and its use in biofilm bioreactors

The non-conventional yeast Yarrowia lipolytica is widely investigated for its unusual metabolic properties. Among them is the ability of Y. lipolytica to adopt an ovoid or hyphal morphology according to environmental conditions. The mechanism of dimorphic transition involves numerous genes, which have been poorly documented to date. Here, we report on the isolation of a filamentous mutant from an insertion mutagenesis library, the subsequent identification of the mutated gene, and the use of this filamentous mutant in biofilm bioreactors

Online flow cytometry, an interesting investigation process for monitoring lipid accumulation, dimorphism, and cells\u2019 growth in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica JMY 775

Abstract This study aims to understand and better control the main biological mechanisms and parameters modulating the various phenomena affecting Yarrowia lipolytica JMY775 and its lipids accumulation. The results obtained in this study stress forward that the use of an original tool, consisting of coupling bioreactors to online flow cytometry, is highly efficient. Throughout 48\ua0h of culturing, this emerging process allowed an online continuous observation of the effects of pH and/or aeration on the cell growth and dimorphism and lipid accumulation by Y. lipolytica . This present study showed clearly that online flow cytometry is an advantageous tool for the real-time monitoring of microbial culture at a single-cell level. Indeed, the present investigation showed for the first time that profiling of the various phenomena and their monitoring upon culture time is now possible by coupling online cytometry with culture bioreactors