Identifizierung von Effektoren der Pheromon-MAPK-Kaskade in Ustilago maydis

Die sexuelle Entwicklung von Ustilago maydis, dem Erreger des Maisbeulenbrandes, wird durch die Fusion zweier haploider Sporidien eingeleitet. Das aus der Zellfusion hervorgehende Dikaryon ist dann in der Lage die Maispflanze zu infizieren. Diese Entwicklungsprozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der biallelische a-Locus kodiert für ein Pheromon-Pheromonrezeptorsystem, das die Zell-Zellerkennung und die anschließende Zellfusion gewährleistet. Der multiallelische b-Locus kodiert für zwei Homeodomänenproteine, bE und bW, die nur in bestimmten Kombinationen heterodimerisieren und weitere Entwicklungsschritte ermöglichen. Während der Zell-Zellerkennung induziert das Pheromonsignal die Ausbildung von Konjugationshyphen und die Transkription der a- und b-Paarungstypgene. Die Induktion der a- und b-Gene erfolgt über den Transkriptionsfaktor Prf1, der über den cAMP-Signalweg und das Pheromon-MAPK-Modul posttranskriptionell aktiviert wird. Das aktive MAPK-Modul induziert zusätzlich die Transkription von prf1 und ist außerdem für die Ausbildung der Konjugationshyphen verantwortlich. Prf1 wird für die Konjugationshyphenbildung jedoch nicht benötigt. Diese Ergebnisse früherer Arbeiten deuteten auf die Existenz von weiteren unterhalb des MAPK-Moduls agierenden Regulatoren der Pheromonantwort hin. In dieser Arbeit wurden mit Rop1 und Hmg3 zwei HMG-Domänen-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die wie Prf1 zur sequenzspezifisch DNA-bindenden Klasse dieser Proteinfamilie gehören. Während hmg3-Deletionsmutanten zwar einen schwachen Zellfusions- und Pathogenitätsdefekt zeigten, jedoch nach Pheromonstimulation Konjugationshyphen bildeten und lediglich eine leicht reduzierte Expression des Pheromongens aufwiesen, führte die Deletion von rop1 zum Verlust der Pheromon-induzierten Genexpression sowie der Konjugationshyphenbildung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass rop1 selbst in Stämmen, die eine konstitutiv aktive Variante der MAPKK Fuz7 exprimieren für die Transkription von prf1 sowie die a- und b-Genexpression erforderlich ist. Dieser Ansatz ergab auch, dass rop1 an der Ausbildung von Konjugationshyphen nur indirekt beteiligt ist. Desweiteren wurden die starken Zellfusions- und Filamentationsdefekte von Drop1-Stämmen durch die konstitutive Expression von prf1 komplementiert, was darauf hindeutete, dass Rop1 einen entscheidenden Regulator der prf1-Expression darstellt. Gelretardationsexperimente ergaben dann, dass Rop1 in vitro spezifisch an den prf1-Promotor bindet und ermöglichten ferner die Identifizierung eines DNA-Bindemotivs, das sich in einer Reihe weiterer putativer Promotorregionen des U. maydis Genoms findet. In Northern-Analysen konnte gezeigt werden, dass das genetisch aktivierte MAPK-Modul die rop1-Expression über die MAPK Kpp2 induziert. Im Gegensatz dazu führte die genetische Aktivierung des cAMP-Signalweges zur Repression der rop1-Expression. Überraschenderweise exprimierten rop1-Deletionsmutanten auf der Pflanzenoberfläche ausreichend prf1, um alle Entwicklungsstadien zu durchlaufen und volle Pathogenität zu entwickeln. Dies deutet auf die Existenz von zusätzlichen Regulatoren der prf1-Expression auf der Pflanze hin

Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der pathogenen Entwicklung von Ustilago maydis

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Eine erfolgreiche Infektion der Maispflanze durch den phytopathogenen Basidiomyzeten ist abhängig von zahlreichen morphologischen Transitionen, wie beispielsweise die pheromoninduzierte Bildung von Konjugationshyphen, der Wechsel zum dikaryotischen Wachstum nach der Fusion zweier kompatibler Sporidien und das verzweigte Wachstum des Myzels nach dem Eindringen des Pilzes in die Wirtspflanze. Unter Verwendung einer bioinformatischen Analyse konnten im Vorfeld dieser Arbeit bereits 24 offene Leserahmen (ORF) identifiziert werden, die für potenziell RNA-bindende Proteine kodieren und den Ausgangspunkt dieser Arbeit darstellten. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von 3 PUM-, 4 KHD- und 11 RRM-Proteinen auf die Entwicklungsprogramme über einen revers-genetischen Ansatz untersucht. Durch eine extensive phänotypische Analyse konnte für die Genprodukte dreier ORFs ein Einfluss auf die Entwicklung von U. maydis festgestellt werden; die Proteine wurden mit Khd1, Khd4 bzw. Rrm4 bezeichnet. Während die Deletion von khd1 zu einem kältesensitiven Verhalten führt, hat die Deletion von khd4 Veränderungen der Sporidienmorphologie, Wachstumsrate, Pheromonantwort sowie der Pathogenität zur Folge. Die Deletion von rrm4 führt zu einem Verlust des schnellen polaren Wachstums und zu einer reduzierten Virulenz. Die Domänenarchitektur von Rrm4 zeigt Ähnlichkeiten mit Proteinen der ELAV-Familie (embryonic lethal and abnormal vision). Neben den drei für ELAV-Proteine typischen Modulen der RRM-Domäne im N-Terminus, besitzt Rrm4 eine zusätzliche C-terminale PABC-Domäne (poly[A]-binding protein C-terminal domain), die als Proteininteraktionsdomäne bekannt ist. Rrm4 akkumuliert PABC-abhängig in zytoplasmatischen Partikeln, die sich bidirektional entlang des Mikrotubulizytoskeletts bewegen. Bei der Untersuchung des Transportmechanismus konnte eine indirekte Beteiligung des konventionellen Kinesins Kin2 gezeigt werden, weshalb die Beteiligung eines weiteren Motorproteins am plusendgerichteten und des Dyneins am minusendgerichteten Partikeltransport vermutet wird. Darüber hinaus lassen Mutationsstudien an den RRM-Domänen eine Beteiligung der ersten beiden RRM-Domänen an der RNA-Bindung vermuten. Die Bedeutung von Rrm4 auf die Pathogenität von U. maydis und die Bewegung des RNA-bindenden Proteins entlang des Mikrotubulizytoskeletts deuten auf eine wichtige Funktion von RNA-Transport während der pathogenen Entwicklung von U. maydis hin

A two-component regulatory system for self/non-self recognition in Ustilago maydis

AbstractIn U. maydis the multiallelic b locus controls sexual and pathogenic development. In the b locus a gene coding for a regulatory protein had been identified, and it was suggested that the interaction of two b polypeptides specified by different alleles programs sexual development in this fungus. We now demonstrate the existence of a second regulatory gene in the b locus. We term this gene bW and refer to the former as the bE gene. Both genes exist in many alleles. Although unrelated in primary sequence, both genes are similar in their overall organization. The gene products display allele-specific variability in their N-terminal domains, show a high degree of sequence conservation in the C-terminal domains, and contain a homeodomain-related motif. Genetic evidence is provided to show that the pair of bE and bW polypeptides encoded by different b alleles is the key regulatory species

The power of discussion : Support for women at the fungal Gordon Research Conference

We would like to thank Abigail LaBella for sharing the pictures taking during the session and Felicia Wu for her suggestions. We are grateful to all the colleagues that helped leading the discussion groups and all the participants of the session.Peer reviewedPostprin

Fungal model systems and the elucidation of pathogenicity determinants

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