Multiple Weak Linear Motifs Enhance Recruitment and Processivity in SPOP-Mediated Substrate Ubiquitination

AbstractPrimary sequence motifs, with millimolar affinities for binding partners, are abundant in disordered protein regions. In multivalent interactions, such weak linear motifs can cooperate to recruit binding partners via avidity effects. If linear motifs recruit modifying enzymes, optimal placement of weak motifs may regulate access to modification sites. Weak motifs may thus exert physiological relevance stronger than that suggested by their affinities, but molecular mechanisms of their function are still poorly understood. Herein, we use the N-terminal disordered region of the Hedgehog transcriptional regulator Gli3 (Gli31-90) to determine the role of weak motifs encoded in its primary sequence for the recruitment of its ubiquitin ligase CRL3SPOP and the subsequent effect on ubiquitination efficiency. The substrate adaptor SPOP binds linear motifs through its MATH (meprin and TRAF homology) domain and forms higher-order oligomers through its oligomerization domains, rendering SPOP multivalent for its substrates. Gli3 has multiple weak SPOP binding motifs. We map three such motifs in Gli31-90, the weakest of which has a millimolar dissociation constant. Multivalency of ligase and substrate for each other facilitates enhanced ligase recruitment and stimulates Gli31-90 ubiquitination in in vitro ubiquitination assays. We speculate that the weak motifs enable processivity through avidity effects and by providing steric access to lysine residues that are otherwise not prioritized for polyubiquitination. Weak motifs may generally be employed in multivalent systems to act as gatekeepers regulating post-translational modification

Einsatz von demineralisierter humaner Knochenmatrix (DBM) als Trägermaterial im Tissue Engineering von humanen Knorpelgeweben

Demineralisierte Knochenmatrix (DBM) bovinen Ursprungs zeigte in früheren Studien in vitro als auch in vivo viel versprechende Ergebnisse. Seit dem Auftreten der Kreutzfeld-Jakob-Krankheit ist die Anwendung von DBM bovinen Ursprungs kritisch zu sehen. In jüngster Zeit wurde DBM humanen Ursprungs als geeignetes Biomaterial bei der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Chondrozyten wiederentdeckt. In dieser Studie sollte DBM als Trägermaterial von Chondrozytenkulturen in vitro getestet werden. Dazu besiedelten wir demineralisierte Spongiosa, welche zur Sterilisation u.a. mit Peressigsäure behandelt wurde, mit humanen Chondrozyten des Nasenseptums in unterschiedlichen Zellkonzentrationen. Es konnten sich allerdings nach Kultivierung keine vitalen Zellen darstellen lassen. In weitergehenden auf Toxizität prüfenden Untersuchungen zeigte sich, dass das Vorhandensein von DBM zum fehlenden Nachweis von vitalen Zellen führte und Zellkulturmedium, welches mit DBM kultiviert wurde in einem anderen Ansatz das Zellwachstum der Chondrozyten hemmte. Eine Freisetzung von H+ -Ionen als Zeichen eines toxischen Effektes von DBM auf die Zellen konnte mittels pH- Metrie ebenso wenig wie ein möglicher Austritt von Peressigsäure aus DBM beobachtet werden. In der Immunhistochemie und im Western Blot wurden die Ansätze auf Kollagen Typ I, II und Kaspase untersucht. Mit den Zytotoxizitäts- und Proliferationsuntersuchungen mittels ELISA testeten wir die Wirkung von DBM auf Chondrozyten in Abhängigkeit von der Konzentration des DBM und der Dauer der Einwirkung von DBM auf die Zellen. Als nächster Schritt ist die Gaschromatografie zur Überprüfung einer eventuellen Freisetzung von Peressigsäure und Chloroform aus dem DBM geplant