Enhanced growth and recombinant protein production of Escherichia coli by a perfluorinated oxygen carrier in miniaturized fed-batch cultures

Background: Liquid perfluorochemicals (PFCs) are interesting oxygen carriers in medicine and biotechnology with a high solubility for oxygen. They have been repeatedly used for improving oxygen transfer into prokaryotic and eukaryotic cell cultures, however their application is still limited. Here we show the great benefit of air/oxygen saturated perfluorodecalin (PFD) for high cell density cultivation of Escherichia coli in microwell plates and their positive effect on the soluble production of a correctly folded heterologously expressed alcohol dehydrogenase. Results: In EnBase® cultivations the best effect was seen with PFD saturated with oxygen enriched air (appr. 10 μM oxygen per ml) when PFD was added at the time of induction. In contrast the effect of PFD was negligible when it was added already at the time of inoculation. Optimisation of addition time and content of loaded oxygen into the PFD resulted in an increased the cell density by 40% compared to control cultures, and correspondingly also the product yield increased, demonstrated at the example of a recombinant alcohol dehydrogenase. Conclusions: PFCs are a valuable additive in miniaturized cell culture formats. For production of recombinant proteins in low cell density shaken cultures the addition of oxygen-enriched PFD makes the process more robust, i.e. a high product yield is not any more limited to a very narrow cell density window during which the induction has to be done. The positive effect of PFD was even more obvious when it was added during high cell density cultures. The effect of the PFD phase depends on the amount of oxygen which is loaded into the PFD and which thus is a matter of optimisation

High cell density cultivation and recombinant protein production with Escherichia coli in a rocking-motion-type bioreactor

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Single-use rocking-motion-type bag bioreactors provide advantages compared to standard stirred tank bioreactors by decreased contamination risks, reduction of cleaning and sterilization time, lower investment costs, and simple and cheaper validation. Currently, they are widely used for cell cultures although their use for small and medium scale production of recombinant proteins with microbial hosts might be very attractive. However, the utilization of rocking- or wave-induced motion-type bioreactors for fast growing aerobic microbes is limited because of their lower oxygen mass transfer rate. A conventional approach to reduce the oxygen demand of a culture is the fed-batch technology. New developments, such as the BIOSTAT^®CultiBag RM system pave the way for applying advanced fed-batch control strategies also in rocking-motion-type bioreactors. Alternatively, internal substrate delivery systems such as EnBase^®Flo provide an opportunity for adopting simple to use fed-batch-type strategies to shaken cultures. Here, we investigate the possibilities which both strategies offer in view of high cell density cultivation of <it>E. coli </it>and recombinant protein production.</p> <p>Results</p> <p>Cultivation of <it>E. coli </it>in the BIOSTAT^®CultiBag RM system in a conventional batch mode without control yielded an optical density (OD₆₀₀) of 3 to 4 which is comparable to shake flasks. The culture runs into oxygen limitation. In a glucose limited fed-batch culture with an exponential feed and oxygen pulsing, the culture grew fully aerobically to an OD₆₀₀of 60 (20 g L^-1cell dry weight). By the use of an internal controlled glucose delivery system, EnBase^®Flo, OD₆₀₀of 30 (10 g L^-1cell dry weight) is obtained without the demand of computer controlled external nutrient supply. EnBase^®Flo also worked well in the CultiBag RM system with a recombinant <it>E. coli </it>RB791 strain expressing a heterologous alcohol dehydrogenase (ADH) to very high levels, indicating that the enzyme based feed supply strategy functions well for recombinant protein production also in a rocking-motion-type bioreactor.</p> <p>Conclusions</p> <p>Rocking-motion-type bioreactors may provide an interesting alternative to standard cultivation in bioreactors for cultivation of bacteria and recombinant protein production. The BIOSTAT^®Cultibag RM system with the single-use sensors and advanced control system paves the way for the fed-batch technology also to rocking-motion-type bioreactors. It is possible to reach cell densities which are far above shake flasks and typical for stirred tank reactors with the improved oxygen transfer rate. For more simple applications the EnBase^®Flo method offers an easy and robust solution for rocking-motion-systems which do not have such advanced control possibilities.</p

Endophyten als Quelle des polypeptiden Antibiotikums Fengycin und des polyketiden Antibiotikums Bacillaene : Entwicklung eines Produktionsprozesses für Fengycin

Endophytic bacteria, which populate plant tissues, can influence physiological processes in plants. They also have antagonistic effects against many phytopathogens. Utilization of these bacteria as a biological agent for protection of plants is an environmentally friendly alternative to chemical methods. Moreover, since plants belong to the eukaryotic organisms, antibiotics produced by endophytes may have reduced cell toxicity. Therefore, the antimicrobial compounds isolated from endophytes have a big potential for the pharmaceutical industry and agriculture. Potato plants were chosen as source of endophytes due to their ability to protect themselves from a broad spectrum of phytopathogens. Several bacterial strains having antifungal activities were isolated from potato tubers. One strain, which exhibited the strongest fungicide potential, was characterized and identified as Bacillus subtilis subsp. subtilis. It was deposited under the number DSM 21393 at the public collection of the DSMZ GmbH (Germany). The substances exhibiting antifungal activities were purified and after structure elucidation identified as the lipopeptide antibiotic fengycin. Due to its very strong fungicide as well as bactericide and anti-cancer properties this antibiotic has a good potential for applications in the pharmaceutical industry and agriculture. Furthermore, it exhibits strong surface active properties, which makes it of great interest as biosurfactant. Despite the great potential of lipopeptides, the industrial use of these antibiotics is still limited due to their high production costs, which result primarily from low strain productivity and difficulties in bioprocess design as well as downstream processing. Therefore, a further aim of this project was the development of a cost-effective production process for fengycin. Different complex substrates such as malt-, potato extracts and molasses as well as their mixtures were used as culture media. The maximum fengycin yield of 325mg/L was obtained in the optimized medium containing malt and potato extract. As the preparation of potato extract for a larger cultivation scale is not practicable, a side-product of starch production - potato fruit juice (PFJ) was used as an alternative. A fengycin yield up to 550mg/L could be achieved by applying this medium. The utilization of the medium containing malt extract and PFJ led not only to an enhanced fengycin yield but also reduced the production costs of fengycins. Moreover, during the purification experiments it was seen, that another antibiotic family called bacillaene was co-synthesized at high concentrations (up to 400mgL−1). This antibiotic having a broad spectrum of antibacterial activities belongs to the polyketide antibiotics. Other cultivation parameters such as temperature and inoculum quantity were shown to have influence on the cultivation process and fengycin yield. Moreover, it was shown, that the aeration strategy during cultivation was a crucial parameter influencing the production of both antibiotics fengycin and bacillaene. Thereby, a high aeration rate was favorable for bacillaene synthesis whereas the limited aeration rate induced and even could enhance fengycin synthesis rate. Moreover, process selectivity toward fengycin production could be increased from 37% up to 82% by decreasing the aeration rate. A key bottleneck for the application of lipopeptides on an industrial scale is the process development under extreme foam formation. In this project an in situ product removal (ISPR) strategy based on a foam collection was developed. The specialty of this system was the combination of foam fractionation with an adsorption-desorption process on polystyrene resins, which is more efficient than other commonly used ISPR techniques. Application of this ISPR technique not only allowed for a stable and efficient cultivation of B.subtilis DSM 21393 under intensive foaming conditions without the need to add anti-foam agents but also led to an increase in fengycin yield up to 1g/L. Using the developed ISPR strategy bacillaene yield could be also enhanced up to 550mg/L. Due to their low concentration, downstream processing of lipopeptides is relatively expensive. A novel cost-effective method based on a removal and separation of biosurfactants from the culture broth by compressing and harvesting of the liquid surface layer using a new device called Flounder was investigated. The Flounder can be efficiently applied for the separation and concentration of fengycin. The fengycin concentration in the collected fractions was found to be four times higher than in the culture centrifugate. A separation of fengycin from the less surface-active bacillaene could be achieved due to a stronger surface activity of fengycin. The process design for fengycin production from strain isolation via integration of an ISPR technique and production in 60L scale up to downstream of the target product was shown in this project. Thereby, the crucial production parameters for fengycin were determined. The proposed bioprocess development strategy could be easily adapted for the production of other lipopetides/biosurfactants.Endophytische Bakterien besiedeln innere Pflanzengewebe und können physiologische Prozesse in den Pflanzen beeinflussen. Außerdem haben viele Endophyten antibiotische Wirkung gegen Phytopathogene. Damit stellen sie eine umweltfreundliche Alternative zu den chemischen Pestiziden dar und können als biologische Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden. Da die Pflanzen eukariotische Organismen sind, könnten die von Endophyten produzierten Antibiotika eine niedrige Toxizität aufweisen. Dies alles macht diese Antibiotika sehr attraktiv für die Anwendung in der pharmazeutischen Industrie sowie in der Landwirtschaft. In diesem Projekt wurden Endophyten aus Kartoffelpflanzen isoliert. Die Tatsache, dass Kartoffelpflanzen sehr resistent gegen eine große Bandbreite von Phytopathogenen sind, macht diese zu einer interessanten Quelle von Endophyten. Es wurden mehrere bakterielle Stämme mit antifungaler Wirkung gegen verschiedene Pilze aus Kartoffelknollen isoliert. Ein Stamm, der das größte fungizide Potenzial aufwies, wurde charakterisiert und als Bacillus subtilis subsp.subtilis identifiziert. Dieser Stamm wurde unter der Nummer DSM 21393 bei der öffentlichen Stammsammlung der DSMZ GmbH (Deutschland) hinterlegt. Die von diesem Stamm produzierten antifungalen Substanzen wurden aufgereinigt und nach der Strukturaufklärung als das Lipopeptid-Antibiotikum Fengycin identifiziert. Dieses Antibiotikum hat neben sehr starker antifungizider auch antibakterielle und Antitumor-Aktivitäten. Außerdem weist Fengycin starke oberflächenaktive Eigenschaften auf, die es für die Anwendung als Biotensid attraktiv machen. Trotz des großen Potenzials dieser Lipopeptide ist ihre industrielle Anwendung sehr eingeschränkt. Die Hauptursachen dafür sind hohe Produktionskosten, die überwiegend durch eine niedrige Stammproduktivität, einen aufwendigen Bioproduktionsprozess sowie kostspielige Aufreinigung entstehen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war deswegen die Entwicklung eines kosteneffektiven Produktionsverfahrens für Fengycin. Als Kultivierungsmedien wurden verschiedene Substrate wie Malz-, Kartoffelextrakte und Melasse sowie Kombinationen von ihnen eingesetzt. Die maximale Fengycin-Ausbeute von 325mg/L wurde in einem optimierten Medium aus Malz- und Kartoffelextrakt erzielt. Da die Zubereitung von Kartoffelextrakt für einen größeren Kultivierungsmaßstab nicht praktikabel ist, wurde ein Nebenprodukt der Stärkeherstellung - Kartoffelfruchtwasser - als Alternative verwendet. Beim Einsatz dieses Mediums konnte eine Fengycin-Ausbeute von 550mg/L erzielt werden. Die Anwendung des Mediums aus Malzextrakt und Kartoffelfruchtwasser ermöglichte nicht nur eine erhöhte Fengycin-Ausbeute, sondern auch eine Reduzierung der Produktionskosten. Im Laufe der Aufreinigung wurde festgestellt, dass der isolierte Stamm B.subtilis DSM 21393 ein weiteres Antibiotikum, Bacillaene, in sehr hoher Konzentration (bis zu 400mg/L) synthetisiert. Dieses Antibiotikum gehört zu den Polyketidantibiotika und hat ein breites antibakterielles Spektrum. Desweiteren wurde gezeigt, dass andere Kultivierungsparameter wie Temperatur und Volumen des Inokulums das Kultivierungsverfahren und die Fengycin-Ausbeute beeinflussten. Außerdem wurde festgestellt, dass die Belüftungsstrategie ein entscheidender Parameter ist, der die Produktion von beiden Antibiotika, Fengycin und Bacillaene, sehr stark beeinflusst. Dabei zeigte eine hohe Belüftungsrate einen positiven Einfluss auf die Bacillaene-Synthese, während bei einer limitierten Belüftungsrate die Fengycin-Synthese induziert und sogar erhöht werden konnte. Darüber hinaus konnte die Prozessselektivität bei den niedrigen Belüftungsraten in Richtung Fengycin-Produktion von 37% auf 82% gesteigert werden. Die größte Herausforderung für die Prozessenwicklung von Fengycin im industriellen Maßstab ist die Prozessführung unter einer extremen Schaumbildung. In der vorliegenden Arbeit wurde eine in-situ-Strategie für die Produktabtrennung (ISPR), basiert auf der Abtrennung des Schaums, entwickelt. Die Besonderheit dieses Systems besteht in der Kombination von Schaumabtrennung mit der parallelen Adsorption von Fengycin auf einem Adsorberharz, welches diese Technik viel effizienter macht als andere Schaumabtrennungsverfahren. Die Anwendung dieser ISPR-Technik ermöglichte nicht nur eine stabile und effiziente Kultivierung von B.subtilis DSM 21393 unter intensiver Schaumbildung ohne Zusatz von Antischaummitteln sondern auch eine Steigerung der Fengycin-Ausbeute auf bis zu 1g/L. Die Ausbeute von Bacillaene konnte dabei bis auf 550mg/L erhöht werden. Niedrige Konzentrationen von produzierten Lipopeptiden stellen ein großes Problem bei dem Aufreinigungsprozess dar und verursachen hohe Kosten. Im Rahmen dieser PhD Arbeit wurde eine neue kostengünstige Methode unter Verwendung eines Gerätes namens "Flounder" für die Aufreinigung von Lipopeptiden untersucht. Das Aufreinigungsprinzip der "Flounder" basiert auf dem Komprimieren und anschließend Absaugen der Biotenside-Schicht. Es wurde gezeigt, dass diese Methode für die Abtrennung und Konzentrierung von Fengycin effektiv ist. Die Konzentration von Fengycin in den gesammelten Fraktionen war viermal höher als im Kulturüberstand. Dabei konnte Fengycin von dem weniger oberflächenaktiven Bacillaene abgetrennt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Prozessdesign für die Fengycinherstellung, von der Stammisolierung über die Integration der ISPR-Technik und die Produktion im 60L Maßstab bis hin zur Aufreinigung vom Zielprodukt, entwickelt. Alle wichtigen Prozessparameter für die Fengycinproduktion wurden dabei ermittelt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene Bioprozessstrategie könnte für die Herstellung von anderen Lipopeptiden/Biotensiden ohne großen Aufwand angepasst werden