Effect of maturation promoters, ABA, PEG and maltose in the production of nitric oxide and reactive species in Araucaria angustifolia embryogenic cultures

Araucaria angustifolia é uma conífera nativa do Brasil de importância econômica, que, após intenso desmatamento, possui sua distribuição limitada a aproximadamente 3% da área original. Atualmente está incluída na lista de espécies ameaçadas de extinção, na categoria de perigo crítico de acordo com a IUCN (International Union for Conservation of Nature). A embriogênese somática é um processo em que, através da técnica de cultivo in vitro, células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão origem a embriões. Este é um sistema com potencial de aplicação em conservação, reflorestamento, propagação em larga escala, e melhoramento vegetal em espécies arbóreas recalcitrantes e em risco de extinção. Um dos principais fatores limitantes, nos sistemas de embriogênese somática em arbóreas, é a baixa freqüência de maturação e conversão de embriões somáticos em plântulas. Durante a fase de maturação, os embriões somáticos acumulam substâncias de reserva, reduzem a atividade metabólica e adquirem tolerância à desidratação. A suplementação do meio de cultura com determinados reguladores de crescimento e agentes osmóticos, os quais permitem a progressão do desenvolvimento normal dos embriões somáticos, promove um estresse hídrico. Esta situação mimetiza aquela que ocorre durante a embriogênese zigótica quando do desenvolvimento da semente. O óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas que atuam nas respostas das plantas aos vários estresses ambientais e estão envolvidas em processos de desenvolvimento como embriogênese e germinação de sementes, gravitropismo, formação de raízes. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de promotores de maturação, ABA e os agentes osmóticos, PEG e maltose, no conteúdo de NO e ROS em culturas embriogênicas de A. angustifolia. Foi observado que os agentes promotores da maturação reduzem a síntese endógena de NO e ROS. Essa redução é dose dependente. Foram pesquisadas duas linhagens de células com diferentes capacidades de maturação. Para as culturas embriogênicas com competência de maturação esses promotores induzem a maturação e nas culturas que não maturam, promovem a morte celular programada.Araucaria angustifolia is a native conifer of economic importance in Brazil. Due its massive deforestation, this species is now limited to only 3% of the original area. A. angustifolia is currently on the list of endangered species in the category of critically endangered according to IUCN (International Union for Conservation of Nature). Somatic embryogenesis is a process that, through the technique of in vitro culture, isolated cells or a small group of somatic cells gives rise to embryos. This is a system with potential application in conservation, reforestation, large-scale propagation and breeding of tree species . A limiting factor in the systems of somatic embryogenesis in trees is the low frequency of embryo maturation and conversion into plantlets. During the maturation, somatic embryos accumulate storage substances, reduce metabolic activity and acquire tolerance to dehydration. The water stress is made by supplementation of culture medium with growth regulators and osmotic agents, which allow the normal development of somatic embryos. This situation mimics that occurs during development of the seed. Nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) are molecules that act in plant responses to various environmental stresses and are involved in developmental processes such as embryogenesis and seed germination, gravitropism, root formation. This study aimed to evaluate the effect of promoters of maturation, ABA and osmotic agents, PEG and maltose in the generation of NO and ROS in embryogenic cultures of A. angustifolia. It was observed that the promoters of maturation reduces the endogenous synthesis of NO and ROS. We investigated two cell lines with different maturation capacities. For responsive cell line these promoters induce maturation and for blocked cell line, promote programmed cell death

Análise proteômica comparativa durante a maturação de culturas embriogênicas de Araucaria angustifolia

A evolução morfogenética dos embriões, durante a embriogênese em plantas, é acompanhada por uma intensa síntese de proteínas LEAs (proteínas da embriogênese tardia) e proteínas de reserva que possuem papel fundamental durante a fase de maturação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ABA e dos agentes osmóticos, polietilenoglicol (PEG) e maltose, na expressão diferencial de proteínas durante a maturação de culturas embriogênicas de A. angustifolia. Culturas embriogênicas de A. angustifolia foram submetidas a cinco tratamentos de maturação: 1) Controle, meio de cultura BM; 2) ABA, meio BM suplementado com ABA (200 µM); 3) PEG, meio BM suplementado com PEG (9%); 4) Maltose, meio BM suplementado com maltose (9%) e; 5) APM, meio BM suplementado com ABA (200 µM), PEG (9%) e maltose (9%). Após 60 dias de cultivo as proteínas totais foram extraídas com tampão uréia:tiouréia (7M:2M), seguido de precipitação em 10% ácido tricloroacético (TCA)/acetona. Alíquotas de 120 µg de proteínas foram isofocalizadas em tiras de gel IPG (gradiente imobilizado de pH) de 11 cm e faixa de pH 4-7, sendo posteriormente submetidas à separação eletroforética em gel de poliacrilamida SDSPAGE 12%. As proteínas foram visualizadas pela coloração com prata e os géis analisados através do programa Image Master 2-D Platinum®. O tratamento PEG resultou na expressão de maior número de proteínas (420 polipeptídeos), enquanto a adição de ABA apresentou 164 polipeptídeos. Os demais tratamentos: Controle, Maltose e APM apresentaram, respectivamente, 347, 322 e 273 polipeptídeos. Todos os tratamentos apresentaram predominância de proteínas com peso molecular entre 30 kDa e 60 kDa. O tratamento suplementado com Maltose apresentou maior porcentagem de polipeptídeos de alto peso molecular (31,4%) quando comparado com os demais tratamentos. A identificação das proteínas expressas diferencialmente pode contribuir para a compreensão do desenvolvimento embrionário, além de auxiliar na otimização dos protocolos de maturação das culturas embriogênicas em A. angustifolia. (FAPESP, CNPq