Untersuchungen zur subzellulaeren Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in Saeugerzellen

YB-1, ein Y-Box-Protein in Saeugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhaengigkeit der intrazellulaeren Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Uebergang von der G1- in die S-Phase oder in der fruehen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhaengigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstuetzt die These, dass YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind. Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfuellen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhaengig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Uebergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstaerkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden. Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, dass YB-1 eine Spezifitaet fuer eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, dass YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluss auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (a-Faktor und Praeprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, dass YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist. Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, dass YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primaeren Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde koennte YB-1 einen Ansatzpunkt fuer die kuenftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten. [YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation. Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified poteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line. Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1. It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.

Expression of multidrug resistance genes MVP, MDR1, and MRP1 determined sequentially before, during, and after hyperthermic isolated limb perfusion of soft tissue sarcoma and melanoma patients

Purpose: Isolated, hyperthermic limb perfusion (ILP) with recombinant human tumor necrosis factor alpha and melphalan is a highly effective treatment for advanced soft tissue sarcoma (STS) and locoregional metastatic malignant melanoma. Multidrug resistance (MDR)-associated genes are known to be inducible by heat and drugs; expression levels of the major vault protein (MVP), MDR1, and MDR-associated protein 1 (MRP1) were determined sequentially before, during, and after ILP of patients. Patients and Methods: Twenty-one STS or malignant melanoma patients were treated by ILP. Tumor tissue temperatures were recorded continuously and ranged from 33.4°C initially to peak values of 40.4°C during ILP. Serial true-cut biopsy specimens from tumor tissues were routinely microdissected. Expression analyses for MDR genes were performed by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and immunohistochemistry. Results: In 83% of the patients, MVP expression was induced during hyperthermic ILP. MVP-mRNA inductions often paralleled the increase in temperature during ILP. Increased MVP protein expressions either were observed simultaneously with the MVP-mRNA induction or were delayed until after the induction at the transcriptional level. Inductions of MDR1 and MRP1 were observed in only 13% and 27% of the specimens analyzed. Temperatures and drugs applied preferentially led to an induction of MVP and were not sufficient to induce MDR1 and MRP1 in the majority of tumors. Conclusion: This study is the first to analyze the expression of MDR-associated genes sequentially during ILP of patients and demonstrates that treatment might lead to increased levels of MVP, whereas enhanced levels of MDR1 and MRP1 remain rare events