CD3 aptamers promote expansion and persistence of tumor-reactive T cells for adoptive T cell therapy in cancer

Instituto Salud Carlos III financed with Feder Funds PI20-01132 (“A way to make Europe”) for F.P. This project has received funding from the European Union Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Skłodowska-Curie Action grant agreement no. 721358 and under the H2020-FETOPEN “DESTINATION” grant agreement no. 899833

DNA origami as a nanoscale tool for T-cell activation

T-Zellen detektieren hochselektiv sogar einzelne Antigene, von Haupthistokompatibilitätskomplexen(MHC) präsentierte körperfremde Peptide, auf der Oberflächevon Antigenpräsentierenden Zellen (APC), obwohl T-Zellrezeptoren (TCR)diese nur mit mikromolarer Affinität binden. Wie dies möglich ist, ist nach wievor ungeklärt, jedoch gibt es indirekte Beweise, die die räumliche Verteilungvon Antigenen auf der APC Oberfläche als einen kritischen Faktor für diesenErkennungsmechanismus sehen.Das Hauptziel dieser Dissertation war, die Notwendigkeit spezifischer räumlicherAnordnungen von TCRs und/oder TCR Liganden für eine effiziente TZellaktivierungzu bestimmen. Dazu wurde eine biomimetische Oberflächezur Zellinteraktion entwickelt, die folgenden Zweck erfüllen sollte: Zum einensollte eine experimentell kontrollierbare und akkurate Positionierung von Ligandenund deren Distanzen zueinander mit Nanometer-Präzision möglich sein.Zum anderen sollte die mikroskopische Reorganisation der Liganden und Rezeptorenim Rahmen der T-Zellaktivierung unterstützt werden. Zu diesem Zweckverwendeten wir rechteckige DNS-Origami Plattformen, die auf einer fluidenplanaren Lipiddoppelschicht (SLB) verankert und mit TCR Liganden funktionalisiertwurden.Wir konnten feststellen, dass T-Zellaktivierung mittels TCR-reaktiver monovalenterAntikörperfragmente (scFV) die unmittelbare Nähe (δ ≤ 20nm) zwischendiesen Liganden voraussetzt. Dies deutet darauf hin, dass sich AntikörpergebundeneTCRs für eine potente Immunantwort in unmittelbarer Nähe zueinanderbefinden müssen.Diese Voraussetzungen galten jedoch nicht für den physiologischen TCR Liganden,Antigen-beladene MHCs (pMHCs), die sehr wohl in der Lage waren, TZellenals isolierte Einheiten zu stimulieren. Bei Verwendung von TCR:pMHCPaaren mit einer erhöhten Interaktionsdauer stellten wir allerdings fest, dass dieentsprechende Signalantwort in Analogie zum scFV von der räumlichen Anordnungder pMHC Moleküle abhing.Unsere Daten deuten im Gesamten darauf hin, dass die T-Zellaktivierung vonkleinen Clustern stimulierter TCRs abhängt. Diese können entweder durch lang anhaltende TCR:Liganden Bindungen entstehen, wobei zumindest zwei TCRsin einem maximalen Abstand von 20nm zueinander stehen müssen, oder durchwiederholte, kurzlebige Interaktionen mit einzelnen pMHC Molekülen gebildetwerden.T-cells recognize the presence of even a single foreign peptide-loaded majorhistocompatibility complex (pMHC) on the surface of antigen presenting cells(APC) even though their T-cell antigen receptors (TCR) bind with micromolaraffinity. How they achieve this is still poorly understood, yet indirect evidencepointed to spatial antigen arrangement on the APC surface as a critical factorfor this recognition process.The main aim of this thesis was to determine the spatial requirements forT-cell activation. For this, we designed a cell-responsive biointerface, whichshould feature experimentally controllable and defined adjustment of liganddistances on the nanoscale while permitting at the same time the microscopicreorganization of ligands and receptors in the course of T-cell activation. To thisend, we employed rectangular DNA origami platforms anchored to fluid planarsupported lipid bilayers (SLB) and functionalized with TCR ligands.We found that T-cell activation via TCR-reactive monovalent single chain antibodyfragments (scFV) requires close proximity (≤ 20nm) of ligands withinunits of at least two molecules, indicating that TCRs must be antibody-engagedin close proximity to initiate a potent immune response.This held no longer true for the physiological TCR ligand, cognate pMHCs,which were well capable of stimulating T-cells as well-isolated entities. However,when we employed TCR:pMHC pairs with increased interaction half-lives,the signaling response was dependent on the spatial organization of pMHCmolecules in analogy to antibody-mediated TCR triggering.Together, our data indicate that early T-cell signaling emerges from small assembliesof triggered TCRs, which can be formed either by prolonged TCR:ligandengagement of closely spaced TCRs or by repeated short-lived interactions viasingle cognate pMHC molecules.20

The behaviour of plasma membrane nanostructures at mild heat shock conditions

Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZusammenfassung in englischer SpracheEin seit Jahrhunderten bewährter Überlebensmechanismus ist 'Fieber', wobei wir im weiteren Kontext von einem Heat-Shock sprechen. Durch den Anstieg der Temperatur über die übliche, physiologische Körpertemperatur wird in den Zellen eine spezifische Reaktion ausgelöst. Dabei werden vermehrt Heat- Shock-Proteine produziert, um den Gleichgewichtszustand der Zelle wieder herzustellen. Fehler oder unvollständige Abläufe in dieser Kaskade sind Bestandteil vieler schwerer Krankheiten. Abgesehen von einer veränderten Expression von Proteinen bzw. einer erhöhten Produktion von Heat-Shock-Proteine können weitere intrazelluläre und extrazelluläre Effekte während und nach einem Heat-Shock beobachtet werden. In dieser Arbeit wird auf Veränderungen der äußeren Seite der Plasmamembran und ein intrazelluläres Feedback von modifizierten Chinese Hamster Ovary-Zellen durch einen Heat-Shock eingegangen. Die Zellen sind dabei über einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker mit einem grün fluoreszierenden Protein versehen. Mit Hilfe spezieller Anwendungsmöglichkeiten der Fluoreszenzmikroskopie wird die Stabilität von Nanoplattformen auf der äußeren Zellmembran für physiologische und erhöhte Temperaturen untersucht. Dabei wird sowohl der zeitliche Verlauf der Nanoplattformen als auch der Oberflächendichte, der Expression und der Mobilität von GFP-GPI-Molekülen durch einen Heat-Shock gezeigt.Weiters werden die Auswirkungen der sauren Sphingomyelinase, der Endozytose und der Polymerisation von Aktin auf die Stabilität der Nanoplattformen veranschaulicht. Zur Überprüfung einer intrazellulären Antwort wird für unterschiedliche Heat-Shock-Szenarien der zeitliche Verlauf des Ca2+-Signals analysiert. Mit Hilfe eines Vergleichs der intrazellulären und extrazellulären Reaktionen wird eine mögliche Erklärung für diese Heat-Shock-Effekte gegeben.During the last centuries there was one specific survival mechanism that proofed itself worthful. In further context we will talk about that survival mechanism, namely fever, and refer to it as -heat-shock-. Due to the rise of temperature above the usual physiological body temperature a specific reaction is triggered in the cells. An increased amount of heat-shock-proteins is produced to reestablish the state of equilibrium of the cell. If errors or incomplete sequences occur during this cascade, the faults can lead to different severe diseases or become parts of such diseases. Besides a changed expression of proteins or a raised production of heat-shock-proteins, further intracellular and extracellular effects during and after a heat-shock can be observed. In this thesis changes of the outer side of the plasmamembrane and an intracellular feedback of modified chinese-hamster-ovary cells affected by a heat-shock are examined. The cells are hereby furnished with a glycosylphosphatidylinositol-anchor with a green fluorescent protein. With the aid of special application possibilities of the fluorescence microscopy the stability of nanoplatforms on the outer cellmembrane in the case of physiological and elevated temperatures is investigated. Thereby the time course of nanoplatforms as well as the surface density, the expression level and the mobility of GFP-GPI-molecules affected by a heat-shock are visualized. To check for an intracellular answer, the time course of the Ca2+-signal is analyzed for different heat-shock-scenarios. By comparing the intracellular and extracellular reactions, a possible explanation for those heat-shock-effects is given.13