The Embryonic Stem Cell Test as Tool to Assess Structure-Dependent Teratogenicity: The Case of Valproic Acid

Teratogenicity can be predicted in vitro using the embryonic stem cell test (EST). The EST, which is based on the morphometric measurement of cardiomyocyte differentiation and cytotoxicity parameters, represents a scientifically validated method for the detection and classification of chemicals according to their teratogenic potency. Furthermore, an abbreviated protocol applying flow cytometry of intracellular marker proteins to determine differentiation into the cardiomyocyte lineage is available. Although valproic acid (VPA) is in worldwide clinical use as antiepileptic drug, it exhibits two severe side effects, i.e., teratogenicity and hepatotoxicity. These limitations have led to extensive research into derivatives of VPA. Here we chose VPA as model compound to test the applicability domain and to further evaluate the reliability of the EST. To this end, we study six closely related congeners of VPA and demonstrate that both the standard and the molecular flow cytometry-based EST are well suited to indicate differences in the teratogenic potency among VPA analogs that differ only in chirality or side chain length. Our data show that identical results can be obtained by using the standard EST or a shortened protocol based on flow cytometry of intracellular marker proteins. Both in vitro protocols enable to reliably determine differentiation of murine stem cells toward the cardiomyocyte lineage and to assess its chemical-mediated inhibition

Establishment of molecular markers as part of the advancement of an in vitro embryotoxicity test

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary LiteraturverzeichnisDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Expression differenzierungsspezifischer Gene während der Kardiomyozytendifferenzierung von embryonalen Stammzellen zu untersuchen und nach Auswahl von Kandidatengenen molekulare Marker für Substanzeffekte zu etablieren. Als Basis diente dazu der Embryonale Stammzelltest (EST), eine tierversuchsfreie Alternativmethode, die zur Einschätzung des embryotoxischen Potentials von Substanzen dient (Spielmann et al., 1997). Die Grundlage bildet die Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus (Linie D3), deren Fähigkeit, innerhalb von 10 Tagen kontrahierende Kardiomyozyten auszubilden, als Modell der Embryonalentwicklung verwendet wird. Innerhalb des Differenzierungszeitraumes wurden mittels quantitativer RT-PCR Genexpressionsanalysen von 18 Genen der Herz- und Mesodermentwicklung durchgeführt. Darunter waren die herzmuskelspezifischen Gene des kontraktilen Apparats alpha-MHC, beta-MHC, MLC1, MLC2v, alpha-Actin, alpha-Actinin und Troponin T, Transkriptionsfaktoren der frühen mesodermalen und Herzentwicklung GATA-4, Tbx5, Hand1 und 2, MesP1 und 2, sowie Myocardin, das Cytokin Cardiotrophin-1, der Wachstumsfaktor cripto-1 und zusätzlich die nicht- herzspezifischen Gene Oct4 und NF L. Die Mehrzahl der Gentranskripte konnte während der D3-Zelldifferenzierung in Mustern gefunden werden, die mit ihrer Rolle in vivo in Übereinstimmung stehen. Die Expression wichtiger Transkriptionsfaktoren wie MesP1 und 2, sowie Hand1 und 2 wurde zum ersten Mal in D3-Zellen während der Kardiomyozytendifferenzierung bestimmt. Zur Etablierung molekularer Marker für eine Einschätzung embryotoxischer Effekte auf Genexpressionsebene erfolgte nach Substanzbehandlung exemplarisch die Messung der MesP1-Expression an Tag 5, sowie der MLC1-Expression an Tag 7 und zusätzlich Tag 10. In Substanztests mit elf Substanzen mit bekanntem embryotoxischen Potential in vivo, sowie mit zwei Substanzen ohne umfangreiche In-vivo-Datenlage zeigte sich, dass mit den molekularen Markern bis auf wenige Ausnahmen eine mit der konventionellen mikroskopischen Auswertung vergleichbare Sensitivität erreicht wurde. Die Analyse der Ergebnisse der elf bekannten Testsubstanzen mit Hilfe eines mathematischen Prädiktionsmodells für die Einschätzung des embryotoxischen Potentials (Genschow et al., 2002) führte mit allen vier Endpunkten bis auf zwei Einzelergebnisse immer zur korrekten Klassifikation. Es konnten somit erfolgreich molekulare Marker etabliert werden, von denen zwei schon zu einem früheren Zeitpunkt während der Differenzierung von D3-Zellen eine korrekte Prädiktion des embryotoxischen Potentials einer Substanz ermöglichten. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei, die In-vitro- Kardiomyozytendifferenzierung aus D3-Zellen mit Kenntnissen molekularer Abläufe zu unterlegen und dadurch die Möglichkeiten des EST zu erweitern, als Screening-Test auf embryotoxische Effekte in der frühen Substanzentwicklung eingesetzt zu werden. Die Resultate erlauben eine Verkürzung des Testzeitraumes und durch die Verwendung molekularer Endpunkte wird die Möglichkeit einer Teilautomatisierung geschaffen. Aufgrund der Tatsache, dass mit einem frühen mesodermalen Gen wie MesP1 eine korrekte Prädiktion des embryotoxischen Potentials einer Testsubstanz möglich war, können die präsentierten Ergebnisse dazu beitragen, Gene auszuwählen, die als molekulare Marker für weitere Differenzierungsvorgänge genutzt werden können.The aim of the presented thesis was to study gene expression during cardiomyocyte differentiation in embryonic stem cells and to establish molecular markers for embryotoxic substance effects after selection of appropriate candidate genes. The work was conducted on the basis of the Embryonic Stem Cell Test (EST), an alternative method to animal experiments, which is intended for the prediction of an embryotoxic potential of substances (Spielmann et al., 1997). The EST is based on the differentiation of embryonic stem cells of the mouse (line D3). Their ability to form contracting cardiomyocytes within 10 days of development is used as a model of embryonic development. During the differentiation period the expression of 18 genes with a known in vivo function in early mesoderm or heart differentiation was studied by means of quantitative RT-PCR. This selection contained heart muscle specific genes of the contractile apparatus alpha-MHC, beta-MHC, MLC1, MLC2v, alpha-Actin, alpha-Actinin and Troponin T, transcription factors of early mesodermal and heart development GATA-4, Tbx5, Hand1 and 2, MesP1 and 2, as well as myocardin, the cytokine cardiotrophin-1, the growth factor cripto-1 and, in addition, genes, which are not heart specific (Oct4 and NF L). During the differentiation of D3 cells to cardiomyocytes, the majority of gene specific transcripts was found in patterns that were in accordance with their expression in vivo. The expression of important transcription factors like MesP1 and 2 as well as Hand1 and 2 was determined during in vitro cardiomyocyte differentiation in D3 cells for the first time. In order to establish molecular markers for a prediction of embryotoxic effects on the level of gene expression, the genes MesP1 and MLC1 were chosen as test candidates, whose expression was determined after substance treatment at appropriate time points (MesP1 on day 5; MLC1 on day 7 and in addition on day 10). In substance tests with 11 substances with known embryotoxic potential in vivo and two substances without comprehensive in vivo data, it could be shown that the sensitivity of the molecular markers was comparable with the conventional microscopic endpoint in the majority of cases. An analysis of the results of the 11 known substances with all four endpoints using a mathematic model which was developed for the prediction of an embryotoxic potential (Genschow et al., 2002) lead in all but two single tests to the correct classification. Thus, out of the molecular markers that were established successfully, two lead to a correct prediction of the embryotoxic potential of the substances even earlier than the conventional endpoint. The results of the presented work contribute to understanding the succession of molecular events during in vitro differentiation of cardiomyocytes and, therefore, to improve the possibilities of the EST to be applied as a screening test for embryotoxic effects in early substance development. The results allow to shorten the test duration and with the use of molecular endpoints automation of parts of the test procedure becomes possible. Furthermore, the fact that an early mesodermal gene like MesP1 allowed a correct embryotoxic prediction shows that the presented results can contribute to the selection of genes, which can be used as molecular markers for a wider choice of differentiation processes