Inhibición del sistema de secreción tipo III de Escherichia coli enteropatógena usando péptidos coiled-coil de EspA

Escherichia coli enteropatógena (EPEC) es causa importante de diarrea infecciosa en niños. Este patógeno utiliza el sistema de secreción tipo III translocón (SSTIII-translocón) para inyectar sus factores de virulencia directamente dentro del citoplasma de la célula eucariótica, en donde alteran el citoesqueleto y producen una patología denominada lesión de adherencia y eliminación de las microvellosidades (lesión A/E). Dichas lesiones generan un desbalance electrolítico que ocasiona la diarrea. Por lo que la formación del SSTIII-translocón es un paso indispensable para la patogénesis causada por EPEC. Un componente importante del SSTIII-translocón es el filamento de EspA, que contribuye a la adherencia inicial de la bacteria al enterocito y también permite la translocación de los factores de virulencia al citoplasma de la célula. El filamento está constituido por monómeros de la proteína EspA, que se auto-polimerizan debido a dominios coiled-coil. Se ha demostrado que la alteración de estos dominios afecta el ensamblaje de los filamentos de EspA y previene la formación de lesiones A/E, lo que consecuentemente disminuye la patogénesis generada por EPEC. Recientemente se ha encontrado que péptidos sintéticos coiled-coil de 15 aminoácidos (aa) (CoilA y CoilB) sintetizados con base en la región C-terminal de EspA, son capaces de bloquear el SSTIII-translocón de EPEC. Y se encontró que dicho bloqueo se lleva a cabo mediante la inhibición del ensamblaje de los filamentos de EspA. Estos péptidos podrían ser una alternativa terapéutica posible para combatir la diarrea ocasionada por EPEC. Por lo que el objetivo de este trabajo fue encontrar el núcleo mínimo de los péptidos coiled-coil que pudieran bloquear el SSTIII-translocón de EPEC. Para lo cual se diseñaron tres péptidos de 8 aa con base en la secuencia de CoilA (CoilA1, CoilA2 y CoilA3) y tres más con base en la secuencia de CoilB (CoilB1, CoilB2 y CoilB3). Sin embargo, no fue posible purificar los péptidos CoilA3 y CoilB1 debido a su insolubilidad. Se sabe que cuando EPEC infecta eritrocitos, provoca la lisis de los mismos al generar poros en su membrana cuando se forma el SSTIII-translocón. Nosotros encontramos que al infectar eritrocitos con EPEC preincubada con los péptidos, CoilA1 reduce la hemólisis causada por EPEC incluso de manera más eficiente que CoilA; mientras que CoilA2 reduce de manera similar a CoilA. Encontramos que CoilB2 y CoilB3 no son capaces de inhibir la hemólisis, contrario a lo observado para el péptido del cual provienen (CoilB). Los péptidos CoilA1 y CoilA2 son capaces de reducir eficientemente la adherencia de EPEC y la formación de lesiones A/E cuando se infectan células epiteliales con cultivos de EPEC, que durante la formación del SSTIII-translocón están en presencia de los péptidos. Los péptidos CoilB2 y CoilB3 no disminuyen la adherencia ni la formación de lesiones A/E. Pudimos determinar que la reducción de la adherencia y la formación de lesiones A/E se debe a que los péptidos CoilA1 y CoilA2 son capaces bloquear la polimerización de los filamentos de EspA mientras que CoilB2 y CoilB3 no. Encontramos evidencias claras de que el bloqueo de la polimerización se debe a que cuando EPEC está en presencia de los péptidos CoilA1 y CoilA2, se bloquea la secreción de las proteínas translocadoras EspA, EspD y EspB, las cuales forman el translocón y sin las cuales el SSTIII de EPEC no es funcional. Los péptidos CoilB2 y CoilB3 son incapaces de bloquear la secreción de las proteínas translocadoras, lo cual explica su inefectividad para reducir la patogénesis generada por EPEC. Por lo tanto en este trabajo se demuestra que existe una región mínima de 8 aa (CoilA1) que es más efectiva que su péptido de origen de 15 aa (CoilA) para bloquear el SSTIII-translocón de EPEC