Estudio de interacciones metal-biomolecula en organismos modelos Mus musculus/Mus spretus. Diagnosis de problemas ambientales

La presencia creciente de una gran variedad de contaminantes químicos en el medio ambiente supone un riesgo para la salud de los organismos presentes en ellos y los correspondientes ecosistemas. La monitorización medioambiental convencional de los ecosistemas se lleva a cabo mediante análisis químico de elementos traza tóxicos (por ejemplo, Cd, As, Pb, Hg, etc), contaminantes orgánicos (plaguicidas, PCBs, PAHs), contaminantes emergentes (disruptores endocrinos, productos farmacéuticos, productos para el cuidado de la salud y detergentes) y, recientemente, las nanopartículas. Sin embargo, los análisis químicos tradicionales no permitan conocer si los niveles de contaminantes químicos presentes en el medio ambiente provocan efectos sobre los organismos, especialmente considerando su acción conjunta, y si suponen una amenaza real para los ecosistemas. Todo esto ha provocado el desarrollo de una serie de metodologías que evalúan respuestas biológicas asociadas a la contaminación en organismos vivos usados como bioindicadores de contaminación ambiental, ya que estos reflejan el efecto de los contaminantes sobre el metabolismo celular y la homeostasis global. Entre estas metodologías se encuentran el uso de biomarcadores, parámetros biológicos medidos en los organismos expuestos (bioindicadores) los cuales indican, al alterarse sus niveles, la exposición a contaminantes, sus efectos biológicos o los riesgos de su presencia en los ecosistemas. La evaluación de biomarcadores en organismos vivos puede ayudar a diagnosticar el impacto y riesgo de los contaminantes en los organismos, poblaciones o ecosistemas. El presente estudio considera la evaluación y seguimiento de la contaminación ambiental del Parque Nacional de Dofiana y sus alrededores (situado en la zona suroeste de España). Este entorno natural que fue declarado Reserva de la Biosfera, es un mosaico de ecosistemas con un grado de biodiversidad único en Europa. Sin embargo, está amenazado por diversos factores concurrentes, como las actividades agrícolas desarrolladas en su entorno, la influencia de zonas industriales próximas (Polo Químico de Huelva) y los riesgos derivados de la actividad minera, como demostró el vertido de las Minas de Aznalcollar en 1998. El presente trabajo se ha llevado a cabo en 5 zonas diferentes del Parque Nacional de Doñana y alrededores: Lucio del Palacio (LDP), situado en el interior del Parque, considerada zona no contaminada y utilizada como control y otras 4 zonas situadas en el entorno del Parque, La Rocina (ROC), El Partido (PAR), El Ajolí (AJO) y El Matochal (MAT), con diferentes niveles de contaminación dependiendo de su proximidad a zonas de actividad agrícola, minera o industrial. Se ha usado como especie bioindicadora el ratón de vida libre Mus spretus, que es una especie muy prolífica en estas zonas. Se ha demostrado experimentalmente que el ratón de vida libre Mus spretus es genéticamente homólogo al ratón de laboratorio Mus muscuíus, ya secuenciado, lo que permite utilizar información proteómica y metalómica de Mus muscuíus para identificar proteínas expresadas en el Mus spretus. El estudio de la contaminación ambiental del Parque Nacional de Dofiana y alrededores se ha llevado a cabo mediante el análisis de biomarcadores relacionados con el estrés ambiental, concretamente metalobiomoléculas, utilizando Mus spretus capturado en las cinco zonas de estudio previamente mencionadas. Para ello se ha desarrollado un procedimiento metalómico basado en el acoplamiento de la cromatografía de exclusión de tamaño con detección elemental ICP-MS, el cual se ha aplicado a los extractos citosólicos de diferentes órganos de este ratón (cerebro, hígado y riñón) con objeto de identificar posibles cambios de expresión de metalobiomoléculas como consecuencia de la contaminación ambiental. A su vez, se han llevado a cabo separadamente experimentos de exposición a Cd, As y Hg en Mus muscuíus, con objeto de obtener información de la respuesta biológica de estos organismos modelo, es decir, cambios de expresión de metalobiomoléculas como consecuencia de la exposición a estos contaminantes, y posteriormente comparar estos resultados con aquellos obtenidos en Mus spretus. Para ello, una vez finalizados cada uno de los experimentos de exposición, se analizaron los correspondientes extractos citosólicos de los diferentes órganos de Mus muscuíus (cerebro, hígado y riñón) usando el mismo procedimiento metalómico mencionado anteriormente. El estudio metalómico comparativo de la respuesta biológica de Mus muscuíus sometido a experiencias de exposición y Mus spretus procedente de las zonas de estudio, muestra la sobreexpresión predominante de una fracción que contiene Cd, Cu y Zn, correspondiente a la presencia de metalotioneina, y otra fracción que contiene Cu y Zn correspondiente a la superóxido dismutasa, ambas presentes en hígado y riñón de Mus spretus en las zonas contaminadas ROC y MAT. La presencia de As en esta zonas contaminadas provoca la presencia de especies arsenicales metiladas como MMA y DMA en el hígado y riñón de Mus spretus. Estos resultados indican la interacción de estos metales tóxicos que abundan en las zonas contaminadas con los organismos de vida libre que habitan en ellas. La ausencia de respuesta biológica de Mus spretus en relación a la presencia de Hg confirma la baja incidencia medioambiental de dicho elemento en las áreas consideradas. Los resultados en cerebro no muestran diferencias significativas entre los perfiles de Mus spretus en zonas contaminadas y no contaminadas, posiblemente debido a la actividad de la barrera hematoencefálica que protege dicho órgano. La aplicación de este procedimiento metalómico a las especies Mus spretus /Mus musculus, constituye una buena aproximación analítica para el estudio de la biodisponibilidad y el impacto medioambiental de los metales en los organismos vivos, utilizando la medida de la respuesta biológica de estos frente al estrés medioambiental. Por otro lado, en relación a lo anterior, se ha llevado a cabo el estudio de los complejos metálicos de las metalotioneinas (MT) que se forman en las células hepáticas de Mus musculus sometido a experiencias de exposición a cadmio. Dicho experimento se ha llevado a cabo mediante inyección subcutánea de dosis crecientes de cadmio (en forma de CdCy desde 0,1 a 1 mg/Kg/día durante un total de 10 días. Se consideran tres subgrupos de ratones, A, B y C, correspondientes a subcolonias separadas y sacrificadas los días 2, 6 y 10 de exposición, respectivamente. Por otro lado, se utilizó un grupo control al que se le inyectó subcutáneamente 100 \iL de agua ultrapura diariamente, durante los 10 días del experimento. Los extractos de hígado de Mus musculus de los dos grupos más expuesto, B y C, fueron analizados usando un procedimiento metalómico basado en el uso de un sistema cromatográfico bidimensional, SEC-RPC, acoplado a un sistema de detección elemental como ICP-MS, y en paralelo con un sistema de detección molecular nESI-qTOF-MS, con objeto de aislar, purificar e identificar los complejos metálicos de las metalotioneinas formados durante el experimento de exposición. Los resultados nos permite establecer cambios estequiométricos de los complejos de Cd, Cu y Zn con las isoformas I y II de la metalotioneina a lo largo de la exposición a cadmio, observándose a mitad del experimento la presencia de isoformas parcialmente coordinadas con átomos de Cd (número de átomos de Cd inferior a 7), coexistiendo en la misma molécula con átomos de Cu y Zn. Sin embargo, al progresar la exposición a Cd dichas isoformas evolucionan a especies en las que el Cd ocupa todas las posiciones de coordinación de las MTs (Cd7MT). A su vez, los resultados muestran una mayor afinidad del Cd por la MT I que por la MT II ya que se ha podido observar señales correspondientes a los complejos de MT II con un número de átomos de cadmio inferior al observado para los complejos de MT I. Todos estos resultados proporcionan información sobre evolución de la estequiometria de metales unidos a diferentes isoformas de metalotioneina y la interacción cooperativa entre metales y biomoléculas en las células, como la sustitución de cobre o zinc por cadmio, en hígado de Mus muscuíus a lo largo de la exposición a dosis crecientes de este elemento. El estudio en profundidad de estos complejos metálicos pueden ayudar a esclarecer el papel biológico de las MTs, y los resultados obtenidos se pueden extrapolar a la especie de vida libre, como el Mus spretus, para evaluar la respuesta biológica relacionada con las MTs a largo plazo. De esta forma, se puede evaluar de forma integrada, el impacto de la contaminación ambiental en ecosistemas amenazados.The increasing presence of a variety of chemical contaminants in the environment has a risk to the health of organisms and ecosystems. Monitoring of environmental issues is conventionally performed by chemical analysis of trace toxic elements (e.g. Cd, As, Pb, Hg, etc), organic contaminants (pesticides, PCBs, PAHs), emerging contaminants (endocrine disruptors, pharmaceuticals, health care products and detergents) and recently, nanoparticles. However, traditional chemical analysis do not allow to know if the levels of chemical contaminants in the environment cause effects on organisms, and can threat to ecosystems. All these facts have led to the development of a number of methodologies to assess biological responses associated with contamination in living organisms used as bioindicators of environmental pollution, since they reflect the effect of contaminants on cellular metabolism and global homeostasis. These methodologies include the use of biomarkers, which are biological parameters measured in bioindicator organisms show by the alteration of their levels, the occurrence of pollutants and their biological effects or risks. The assessment of biomarkers in living organisms (bioindicators) can help diagnose the impact and risk of contaminants at certain levels on organisms, populations or ecosystems. This study focuses the assessment and monitoring of environmental pollution of Doñana National Park and surroundings (South West Spain). This natural environment was declared Biosphere Reserve, and is a mosaic of ecosystems with a degree of biodiversity unique in Europe. However, it is threatened by various harmful factors, such as neighboring agricultural, industrial (Chemical Pole of Huelva) and mining activities, as well as the toxic mud spillage from Aznalcollar mine that reached the northeastern boundary of the Park in 1998. The present study was performed in 5 different areas of Doñana National Park and surrounding: one of them located at the center of the Park, Lucio Palacio (LDP), considered as non contaminated area (according to the previous results) which has been used as control and the other four areas, La Rocina (ROC), El Partido (PAR), El Ajolí (AJO) and El Matochal (MAT), located in the surroundings of the Park with different levels of pollution due to their proximity to contamination sources. The free-living mouse Mus spretus has been used as a bioindicator because it is a very prolific species in these areas. It has been experimentally demonstrated that Mus spretus is genetically homologous to the sequenced mouse Mus muscuíus (classical inbred laboratory species), allowing the use of proteomics and metallomics information of Mus musculus to identify proteins over-/down- expressed by Mits spretus. The study to assess the environmental pollution of Doilana National Park and surroundings was performed by analysis of biomarkers related to environmental stress, specifically metallobiomolecules, in Mus spretus captured in the five selected areas previously mentioned. For that reason, a metallomic procedure based on the coupling of size exclusion chromatography (SEC) with elemental detection system ICP-MS has been developed and the cytosolic extracts from different organs (brain, liver and kidney) of this mouse were analyzed in order to identify possible changes in metallobiomolecules expression as a result of environmental pollution. Additionally, exposure experiments of Mus musculus to different toxic metals (Cd, As and Hg), under controlled laboratory conditions, have been performed to obtain information about the biological response of this species (evaluated by change in metallobiomolecules expression) as a result of exposure to these pollutants, for later comparison with those in Mus spretus. For this purpose, after each experiment the corresponding cytosolic extracts from different organs (brain, liver and kidney) of Mus musculus were analyzed using the same metallomic procedure mentioned previously. The comparative metallomic study of the biological response of Mus musculus under exposure experiments and Mus spretus from the areas under study shows predominantly the up-regulation of a fraction containing Cd, Zn and Cu corresponding to the metallothionein, as well as another fraction containing Cu, Zn, corresponding to superoxide dismutase in liver and kidney of Mus spretus from contaminated areas, MAT and ROC. The abundance of As in these contaminated areas provokes the presence of methylated arsenic species as MMA and DMA in liver and kidney of Mus spretus. These results denote the interplay of these toxic metals on free-living organisms from contaminated areas. The absence of response in relation to the presence of Hg confirms the low environmental incidence of this element in the area considered. Brain results show no significant differences between the profiles of Mus spretus from contaminated and uncontaminated areas, possibly due to the blood brain barrier activity. The application of this metallomic procedure to Mus spretus / Mus musculus species is a good analytical approach to assess the bioavailability and environmental impact of metals in living organisms, by evaluating their biological response under environmental stress. On the other hand, the study of metal complexes of metallothioneins (MTs) which are formed in the liver cells of Mus musculus under cadmium exposure has been performed. Exposure experiments were performed by subcutaneous injection (100 (.iL) of increasing doses of 0.1 to 1 mg Cd (in the form of CdCy per kg of body weight per day during a total period of 10 days. Three subgroups of 10 mice (A, B and C) were separated and sacrificed at days 2, 6 and 10 of the experiment, respectively. The control group of mice was subcutaneously injected with 100 [iL of ultrapure water per day for 10 days. Liver extracts of the two most exposed groups, B and C, were analyzed using a developed metallomic procedure based on the use of a two-dimensional chromatography, SEC followed by RPC, combined in parallel with inductively coupled plasma octopole reaction cell mass spectrometry (ICP-ORS-MS) and nanospray ionization time-of-flight mass spectrometry (nESI-qTOF-MS) to isolate, purify and identify the metallothionein metal complexes formed along cadmium exposure experiment. The results allow us to appreciate changes in the stoichiometry of Cd, Cu and Zn complexes with MT isoforms I and II along cadmium exposure. Half of the experiment, these isoforms partially metallated with Cd atoms (number of Cd atoms less than 7) that coexist with Cu and Zn atoms were observed. However, the last days of exposure experiment, completely metallated MT isoforms with Cd atoms (TM7MT) were observed. Additionally, the results show that affinity of Cd for MT I are higher than that for MT II, so that signals corresponding to MT II complexes with a number of cadmium atoms lower than those observed for MT complexes I have been observed. These results provide information about metal-binding stoichiometry of MT and cooperation of metal binding, such us the substitution of copper or zinc by cadmium, in Mas nmsculus liver along cadmium exposure. In-depth study of these metal complexes may help to elucidate the biological role of MTs and additionally the results can be extrapolated to the free-living species Mas spretus to evaluate the biological response of MTs during long term environmental pollution and the impact of environmental pollution in threatened ecosystems

Metabolic impairments caused by a “chemical cocktail” of DDE and selenium in mice using direct infusion triple quadrupole time of flight and gas chromatography mass spectrometry

Among organic contaminants, pesticides are one of the most important groups of chemicals due to their persistent character and toxicity. However, the biological systems are exposed to a complex environment in which the contaminants can interact in a synergistic/antagonistic fashion, and for this reason, the study of “chemical cocktails” is of great interest to fully understand the final biological effect. In this way, selenium is known for its antagonistic action against several toxicants. In this paper, metabolic impairments caused by the joint exposure of p,p′-dichloro diphenyl trichloroethane (DDE) and selenium (Se) have been issued for the first time. A metabolomic workflow was applied to mice fed DDE and DDE with Se diet, on the basis of the complementary use of two organic mass spectrometric techniques, combining direct infusion mass spectrometry (DI-ESI-QqQ-TOF MS) and gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). The results show a good classification between the studied groups caused by about 70 altered metabolites in the liver, kidney, or brain, including the pathways of energy metabolism, degradation of phospholipidic membrane, β-oxidation, and oxidative stress, which confirm the potential of combined metabolomic platforms in environmental studies.This work has been supported by projects CTM2015-67902-C2-1-P and PG2018-096608 B-C21 from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and P12-FQM-0442 and B10-1657 from the Regional Ministry of Economy, Innovation, Science and Employment (Andalusian Government, Spain). G.R.-M. thanks the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness for a PhD scholarship (BES-2013-064501). S.R.-A. thanks the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness for a PhD scholarship (BES-2016-076364). Finally, the authors are grateful to FEDER (European Community) for financial support, Grant Nos. UNHU13-1E-1611 and UNHU15-CE-3140

Residence in an Area with Environmental Exposure to Heavy Metals and Neurobehavioral Performance in Children 9–11 Years Old: An Explorative Study

We explored the association between residence in an area polluted with metals and neurobehavioral performance in children aged 9 to 11. A cross-sectional study was conducted with thirty boys and thirty girls aged 9 to 11 from public schools in a heavily industrialized area, matched by age (±4 months) and gender with 15 boys and 15 girls from public schools in cities without relevant industrial activity. Neurobehavioral performance was assessed with the Behavioral Assessment and Research System. Linear regression models were used, adjusting for age, sex, social class and multimedia activities to predict each of the neurobehavioral outcome variables. No differences in neurobehavioral performance were found when all children with residence in areas with environmental exposure to metals were classified as exposed and the children from the other provinces as unexposed. However, when we compared children living <1 km from an industrial area with respect to those living more than 1 km away, significant differences were found. Children living <1 km away had lower scores on Finger Tapping (p = 0.03), Symbol-Digit (p = 0.07) and Continuous Performance (p = 0.02) than those living farther away. Our results support the hypothesis that residing close to an area with industrial activity (<1 km) is associated with deficits in neurobehavioral performance among children aged 9 to 11: We acknowledge the following schools that helped us with the recruitment of children: CEIP Virgen del Pilar (Huelva), CEIP Prácticas (Huelva), CEIP Virgen de Montemayor (Moguer, Huelva), CEIP Valdelamusa-San Telmo, CEIP Virgen de Andévalo (El Cerro), CEIP Luis Cernuda (Castilleja de la Cuesta, Seville), CEIP Juan XXIII (Castilleja de la Cuesta, Seville) and CEIP Nuestro Padre Jesús (Jabalquinto, Jaen). We would also like to thank Consejería de Educación (Delegación Provincial de Huelva and Delegación Provincial de Jaén) and Consejería de Salud (Delegación Provincial de Huelva) for their support for this study, and to W. Kent Anger for his scientific feedbackDepartamento de Biología Ambiental y Salud PúblicaDepartamento de Ingeniería Química, Química Física y Ciencias de los MaterialesDepartamento de Psicología Clínica, Experimental y Socia