Clostridium difficile flagella induce a pro-inflammatory response in intestinal epithelium of mice in cooperation with toxins

AbstractClostridium difficile is the most important enteropathogen involved in gut nosocomial post-antibiotic infections. The emergence of hypervirulent strains has contributed to increased mortality and morbidity of CDI. The C. difficile toxins contribute directly to CDI-associated lesions of the gut, but other bacterial factors are needed for the bacteria to adhere and colonize the intestinal epithelium. The C. difficile flagella, which confer motility and chemotaxis for successful intestinal colonization, could play an additional role in bacterial pathogenesis by contributing to the inflammatory response of the host and mucosal injury. Indeed, by activating the TLR5, flagella can elicit activation of the MAPK and NF-κB cascades of cell signaling, leading to the secretion of pro-inflammatory cytokines. In the current study, we demonstrate, by using an animal model of CDI, a synergic effect of flagella and toxins in eliciting an inflammatory mucosal response. In this model, the absence of flagella dramatically decreases the degree of mucosal inflammation in mice and the sole presence of toxins without flagella was not enough to elicit epithelial lesions. These results highlight the important role of C. difficile flagella in eliciting mucosal lesions as long as the toxins exert their action on the epithelium.</jats:p

Inhibitory Effect of Ursodeoxycholic Acid on Clostridium difficile Germination Is Insufficient to Prevent Colitis: A Study in Hamsters and Humans

Introduction: Bile acids (BA) influence germination and growth of Clostridium difficile. Ursodeoxycholic acid (UDCA), a BA minor in human, used for cholestatic liver diseases, inhibits germination and growth of C. difficile in vitro, but was never tested in vivo with an infectious challenge versus control. We hypothesized that UDCA could prevent CDI. We evaluated the effects of UDCA on C. difficile in vitro and in hamsters, with pharmacokinetics study and with an infectious challenge. Then, we studied CDI incidence in UDCA–treated patients.Methods: We evaluated germination and growth of C. difficile, with 0.01, 0.05, and 0.1% UDCA. We analyzed fecal BA of hamsters receiving antibiotics and UDCA (50 mg/kg/day), antibiotics, or UDCA alone. Then, we challenged with spores of C. difficile at D6 hamsters treated with UDCA (50 mg/kg/day) from D1 to D13, versus control. In human, we analyzed the database of a cohort on CDI in acute flares of inflammatory bowel disease (IBD). As PSC-IBD patients were under UDCA treatment, we compared PSC-IBD patients to IBD patients without PSC.Results:In vitro, UDCA inhibited germination and growth of C. difficile at 0.05 and 0.1%, competing with 0.1% TCA (with 0.1%: 0.05% ± 0.05% colony forming unit versus 100% ± 0%, P &lt; 0.0001). In hamsters, UDCA reached high levels only when administered with antibiotics (43.5% UDCA at D5). Without antibiotics, UDCA was in small amount in feces (max. 4.28%), probably because of UDCA transformation into LCA by gut microbiota. During infectious challenge, mortality was similar in animals treated or not with UDCA (62.5%, n = 5/8, P = 0.78). UDCA percentage was high, similar and with the same kinetics in dead and surviving hamsters. However, dead hamsters had a higher ratio of primary over secondary BA compared to surviving hamsters. 9% (n = 41/404) of IBD patients without PSC had a CDI, versus 25% (n = 4/12) of PSC-IBD patients treated with UDCA.Conclusion: We confirmed the inhibitory effect of UDCA on growth and germination of C. difficile in vitro, with 0.05 or 0.1% UDCA. However, in our hamster model, UDCA was inefficient to prevent CDI, despite high levels of UDCA in feces. Patients with PSC-IBD treated with UDCA did not have less CDI than IBD patients

Microbiote et santé (caractérisation d'activités fibrolytiques aun sein du microbiote iléal de l'Homme)

Le microbiote intestinal est représenté par une population microbienne anaérobie complexe et très diversifiée, responsables de nombreuses activités métaboliques. Les bactéries fibrolytiques, par exemple, jouent un rôle important dans la dégradation des fibres alimentaires. L'activité de dégradation de ces fibres alimentaires a été clairement démontrée dans le gros intestin mais semble également importante au niveau de l'iléon. Cependant, à ce jour, le potentiel génétique du microbiote iléal n'a pas été élucidé pour la dégradation de glucides complexes tels que les polysaccharides constitutifs des fibres alimentaires. Deux clones métagénomiques d'intérêt, possédant des activités cellulase et xylanase, ont été sélectionnés au sein d'une banque métagénomique iléo-mucosale. Grâce à des études bioinformatiques et la comparaison de leur séquence avec les gènes et génomes de référence du projet MetaHit, ces deux clones ont été identifiés comme appartenant respectivement aux espèces Bacteroides uniformis et Eubacterium rectale, deux bactéries connues pour leurs activités de dégradation des fibres alimentaires dans l'intestin. La prépondérance des protéines portées par ces clones a été déterminée au sein de 884 individus. Plusieurs glycoside hydrolases (CAZymes) sont retrouvées sur les séquences de ces clones, et sont potentiellement responsables des activités enzymatiques observées. Les gènes correspondants ont été étudiés par mutagenèse par transposition et sous-clonage, puis des tests d'activité enzymatique ont été réalisés à partir des extraits bactériens et extracellulaires des clones recombinants. Ces études ont permis de mettre en évidence la responsabilité de deux glycoside hydrolases spécifiques, possédant une double activité cellulase et xylanase, ce qui démontre qu'il existe des microorganismes capables de dégrader les fibres alimentaires au niveau de la muqueuse iléale chez l'Homme.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Impact des conditions environnementales sur l'expression des protéines de surface de clostridium difficile (influence sur le processus de colonisation)

Clostridium difficile est une bactérie responsable de diarrhées nosocomiales et de colites pseudomembraneuses. Ces infections font généralement suite à une antibiothérapie qui altère l effet de barrière du microbiote intestinal. La colonisation du tube digestif par C. difficile est la première étape de l infection. Nous avons montré que certains antibiotiques pourraient exercer un effet direct sur la colonisation en modulant positivement l expression des facteurs de colonisation ; c est le cas de l ampicilline et de la clindamycine pour toutes les souches testées et des fluoroquinolones pour certaines souches épidémiques résistantes à la moxifloxacine. L analyse in vivo du transcriptome bactérien au cours d une cinétique chez la souris monoxénique à C. difficile a permis de clarifier la chronologie des étapes de l infection et d identifier des protéines de surface potentiellement impliquées dans les processus de colonisation, qui seront caractérisées par la suite.Clostridium difficile is responsible for nosocomial diarrhoea and pseudomembranous colitis. C. difficile infection is precipitated by antimicrobial therapy which causes a disruption of the barrier effect of the normal colonic microbiota. The C. difficile intestinal colonization is the first step of the infection. We have shown that several antibiotics could induce the colonization process by enhancing the expression of colonization factors; their expression is increased by ampicillin and clindamycin in all the strains studied and by fluoroquinolones in moxifloxacin-resistant epidemic strains. The in vivo temporal analysis of the bacterial transcriptome in a monoxenic mouse model allowed us to precise the chronology of the pathogenic process and to identify surface proteins potentially involved in the colonization process. These proteins will be characterized soon.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

La lèpre (de l'Antiquité à l'ère génomique)

CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Analyse des facteurs impliqués dans la formation de biofilm de Clostridium difficile

Clostridium difficile est une bactérie entéropathogène responsable de diarrhées et de colites pseudomembraneuses survenant essentiellement à la suite d une antibiothérapie. Les facteurs de pathogénicité majeurs sont les toxines A et B, mais l adhésion aux cellules intestinales et la colonisation colique sont les premières étapes du pouvoir pathogène. Les structures biofilm sont connues pour intervenir dans différents processus de colonisation. L objectif de mon travail était donc d étudier le biofilm de C. difficile. Nous avons montré que les conditions optimales pour l obtention d un modèle reproductible de biofilm en conditions statiques sont une incubation de 3 jours en milieu complexe BHI, à partir de formes végétatives ou de spores. En comparant par microscopie confocale à balayage laser l architecture des biofilms obtenus à partir de différentes souches mutantes isogéniques, les résultats suggèrent que la formation des biofilms est sous la dépendance de deux régulateurs centraux : le répresseur SinR et l effecteur de la répression catabolique CcpA. Des différences ont également été observées avec les mutants de deux protéines de surface : la flagelline FliC et la cystéine protéase Cwp84. Enfin, des résultats obtenus dans un modèle de souris monoxéniques à C. difficile montrent qu après 3 jours d infection, les bactéries s organisent en microcolonies au niveau de caecum de l animal, ce qui pourrait être une étape vers la formation d un biofilm.DIJON-BU Médecine Pharmacie (212312103) / SudocSudocFranceF

La mucoviscidose (généralités et place de la témocilline dans le traitement des infections respiratoires à Burkholderia cepacia)

La mucoviscidose est une maladie génétique héréditaire. Elle résulte dysfonctionnement de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Le mucus respiratoire produit par les cellules qui tapissent les broches fornit un milieu propice au développement d infections bactériennes telles que Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia. Le traitement de ces infections repose sur la bonne stratégie d antibiothérapie. Les infections au complexe Burkhllderia cepacia s avèrent être extrêmement résistances aux antibiothérapies. Cependant dans ceratins cas, le traitement des exacerbations au complexe Burkholderia capacia par la témocilline donne des résultats intéressants et est concluant. La témocilline est un antibiotique qui permet aux patients colonisés par le complexe Burkholderia capacia d améliorer leur qualité de vie et d allonger leur survie.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Emergence et persistance des arboviroses (rôle des diptères nématocères hématophages)

CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Variability of Clostridium difficile Surface Proteins and Specific Serum Antibody Response in Patients with Clostridium difficile-Associated Disease

Pathogen attachment is a crucial early step in mucosal infections. This step is mediated by important virulence factors, such as surface proteins. Clostridium difficile surface proteins have been identified as (i) adhesins (the flagellar cap protein FliD; the flagellin FliC; and the cell wall protein Cwp66 with a two domain-structure [Cw66 N-terminal and Cwp66 C-terminal domains]) and (ii) protease (the Cwp84 protein). To address the roles of these proteins in the pathogenesis of Clostridium difficile and to identify vaccine antigen candidates, we analyzed the variability of the proteins and their immunogenicities in 17 patients with C. difficile-associated disease. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of amplified gene products revealed interstrain homogeneity with fliC and fliD, in contrast to cwp66 genes. Immunoblot analysis showed that FliC and FliD were detected in the majority of isolates. The N-terminal domain of Cwp66 and Cwp84 were present in all strains tested, in contrast to the Cwp66 C-terminal domain, the expression of which was heterogeneous. The 17 sera from the corresponding patients were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies directed against these proteins. Many patients developed antibodies to FliC, FliD, Cwp84, and the Cwp66 C-terminal domain, but not to the Cwp66 N-terminal domain. In conclusion, this study confirms the expression of these surface proteins of C. difficile during the course of the disease. In addition, the FliC, FliD, and Cwp84 proteins appeared to be good potential vaccine candidates