Characterization of the vip3A gene and toxicity of Vip3Aa50 protein to fall armyworm and velvetbean caterpillar

O objetivo deste trabalho foi caracterizar o gene vip3A de Bacillus thuringiensis e verificar a toxicidade da proteína Vip3Aa50 a larvas da lagarta‑do‑cartucho (Spodoptera frugiperda) e da lagarta‑da‑soja (Anticarsia gemmatalis). O gene vip3A foi amplificado por PCR, com iniciadores específicos, e gerou um fragmento de 2.370 pb. Esse fragmento foi clonado em vetor pGEM‑T Easy e, em seguida, sequenciado, subclonado em vetor de expressão pET‑28a (+) e inserido em células de Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína Vip3Aa50 foi induzida por isopropil‑β‑D‑1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), visualizada em SDS‑PAGE e detectada por "Western blot". Os ensaios de toxicidade revelaram alta atividade da proteína Vip3Aa50 contra as larvas neonatas da lagarta‑da‑soja e da lagarta‑do‑cartucho, com CL50 de 20,3 e 79,6 ng cm-2, respectivamente. O gene vip3Aa50 é um novo gene da classe vip3A.The objective of this work was to characterize the vip3A gene of Bacillus thuringiensis and to evaluate the toxicity of Vip3Aa50 protein to the fall armyworm (Spodoptera frugiperda) and velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis) larvae. The gene vip3A was amplified by specific PCR primers, generating a 2,370‑bp fragment. This fragment was cloned into the pGEM‑T Easy vector, and then it was sequenced, subcloned into the pET‑28a (+)’s expression vector, and inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The Vip3Aa50 protein expression was induced by isopropyl‑β‑D‑1‑thiogalactopyranoside (IPTG), visualized in SDS‑PAGE, and detected by Western blot. The toxicity bioassay showed a high activity of Vip3Aa50 protein against both velvetbean and fall armyworm neonate larvae, with LC50 at 20.3 and 79.6 ng cm-2 respectively. The vip3Aa50 gene, is a new gene of vip3A class

Immunostaing of p53 associated with absence of mutations in TP53 gene in dogs with lymphoma

Sabendo-se da influência das mutações no gene TP53 no desenvolvimento das neoplasias e da discrepância entre os resultados obtidos pelas técnicas de sequenciamento e imunoistoquímica, esta pesquisa teve como objetivo relacionar a sequência do TP53 com a imunorreatividade da p53. Foram obtidas amostras de linfoma de 12 cães. O diagnóstico histopatológico foi determinado pela classificação de Kiel. O imunofenótipo e a imunomarcação da p53 foram determinados por imunoistoquímica. Para reação com a p53, utilizou-se anticorpo policlonal anti-p53 (CM1) na diluição de 1:500. A região do gene TP53 compreendida entre os exons quatro e nove foi amplificada por PCR e submetida ao sequenciamento. Apesar dos resultados obtidos pela imunoistoquímica, nenhuma mutação foi encontrada nas sequências analisadas. Conclui-se que a imunorreatividade da p53 pela imunoistoquímica não pode ser atribuída à presença de mutações no domínio central do gene TP53.TP53 mutations are usually involved in cancer, but sequencing and immunohistochemistry results are often controversial. Thus, the aim of this study was to associate TP53 sequence with p53 immunostaining in dogs with lymphoma. Tumor samples were collected from 12 dogs with lymphoma and were included in this study. Histopathological diagnosis was performed according to Kiel classification. Immunohistochemistry was performed to identify immunophenotype as well as p53 expression. Polyclonal antibody anti-p53 (CM1) was used at a 1:500 dilution. The region that encompasses exons 4-9 was amplified by f PCR reactions and sequencing was then performed. Nevertheless, gene mutations were not observed in any sequence. In conclusion, immunoreactivity of p53 by means of immunohistochemistry should not be indicator of presence of mutations in the core domain of TP53 gene

MORPHOLOGIC AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF SPECIES OF Myrciaria spp

A Jabuticabeira é considerada como uma das fruteiras mais típicas do Brasil, contudo há poucos estudos desta planta na literatura e mesmo na literatura especializada, existem muitas controvérsias sobre sua classificação. Este trabalho faz comparações entre as espécies de Jabuticabeiras, usando as técnicas de marcadores morfológicos (Organografia) e moleculares (RAPD). As características morfológicas das plantas, usadas como marcadores morfológicos, foram comparadas com espécimes presentes nos herbários dos Estados de São Paulo e Minas Gerais e através da revisão de literatura especializada. As diferenças moleculares entre as espécies foi determinada através do uso de marcadores moleculares (RAPD). O experimento foi realizado nas cidades de Piracicaba, Jaboticabal e Ituverava, São Paulo, Brasil. Diferenças morfológicas e moleculares entre as plantas estudadas foram identificadas e as mesmas foram agrupadas em quatro grupos distintos, as espécies identificadas foram: Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg, Myrciaria coronata Mattos, Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg., Myrciaria phytrantha (Kiaersk.) Mattos. A técnica de marcadores moleculares aliada à técnica de marcadores morfológicos (organografia), mostrou ser uma ferramenta importante na identificação de espécies de jabuticabeiras. Palavras-chave: Myrciaria, jabuticabeiras, marcadores morfológicos, marcadores moleculares (RAPD)The jabuticaba tree is considered one of the most tipical brasilian fruit tree, however, there are a little of studies of this plant in the literature and even in the specilized literature, there are controversies about its classification many. The present work makes some comparisons between jabuticaba species, using morphologic markers (organography) and molecular markers (RAPD) technique. The morphologic characteristics of the plants, used as morphologic markers, were compared with specimens present on herbaria from São Paulo and Minas Gerais states and through the revision of specialized literature. Molecular differences between the species were identified by molecular in Piracicaba, Jaboticabal and Ituverava cities, São Paulo, Brasil. Morphologic and molecular differences between the studied plants were identified and arranged in four groups, the identified species were: Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg, Myrciaria coronata Mattos, Myrciaria jaboticaba (Vell.) O. Berg., Myrciaria phytrantha (Kiaersk.) Mattos. The technique of molecular markers with the technique of morphologic markers (organography) showed to be an important tool in the identification of jabuticaba tree species. Keywords: Myrciaria, biological identification, morphologic markers, molecular markers (RAPD

Toxicity and binding capacity of Cry1 proteins to Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) intestine receptors

O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade e a capacidade de ligação das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Ca, de Bacillus thuringiensis, a receptores intestinais de Helicoverpa armigera. Realizou-se análise de ligação das proteínas ativadas às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino médio de H. armigera, além de ensaios de competição heteróloga para avaliar sua capacidade de ligação. Cry1Ac destacou-se como a proteína mais tóxica, seguida por Cry1Ab e Cry1Aa. A proteína Cry1Ca não foi tóxica às lagartas e, portanto, não foi possível determinar os seus parâmetros de toxicidade CL50 e CL90. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac são capazes de se ligar a um mesmo receptor nas membranas intestinais, o que aumenta o risco do desenvolvimento de resistência cruzada. Portanto, a utilização conjunta dessas proteínas deve ser evitada.The objective of this work was to evaluate the toxicity and the binding capacity of the Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, and Cry1Ca proteins, from Bacillus thuringiensis, to Helicoverpa armigera intestine receptors. Binding analysis of the activated proteins to the brush‑border membrane vesicles (BBMV) in the midgut of H. armigera, besides heterologous competition assays to evaluate their binding capacity, was performed. Cry1Ac stood out as the most toxic protein, followed by Cry1Ab and Cry1Aa. The Cry1Ca protein had no toxicity to the caterpillars and, therefore, it was not possible to evaluate its LC50 and LC90 toxicity parameters. The Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac proteins are able to bind themselves to the same receptor in the midgut membrane, which increases the risk of developing cross‑resistance. Therefore, the use of these proteins together should be avoided

Relação entre toxicidade de proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a receptores intestinais de lepidópteros‑praga

The objective of this work was to evaluate the toxicity of new Vip3Aa proteins and their binding capacity to brush‑border membrane vesicles (BBMV) in the intestine of Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis, and Heliothis virescens neonate larvae. The proteins expressed by the genes vip3Aa42 and vip3Aa43 showed toxicity to S. frugiperda (LC50 of 78.2 and 113 ng cm‑2, respectively) and A. gemmatalis (LC50 of 239.2 and 57.5 ng cm‑2, respectively), but they showed low toxicity to H. virescens (LC50>5,000 ng cm‑2). BBMV binding assays showed that the proteins bind effectively to the receptors on vesicles of the evaluated species, but this binding capacity is only effective on the activation of toxicity to the evaluated populations of S. frugiperda and A. gemmatalis.O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de novas proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens. Proteínas expressas pelos genes vip3Aa42 e vip3Aa43 mostraram-se tóxicas a S. frugiperda (CL50 de 78,2 e 113 ng cm‑2, respectivamente) e A. gemmatalis (CL50 de 239,2 e 57,5 ng cm‑2, respectivamente), e pouco tóxicas a H. virescens (CL50>5.000 ng cm‑2). Os ensaios de ligação às VMMA mostraram que as proteínas unem-se de forma efetiva aos receptores nas vesículas das espécies avaliadas, mas essa capacidade de ligação somente é efetiva na ativação da toxicidade para as populações avaliadas de S. frugiperda e A. gemmatalis

Interação de proteínas Cry1 e Vip3A de Bacillus thuringiensis para controle de lepidópteros‑praga

The objective of this work was to evaluate the susceptibility of Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae) and Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) caterpillars to Cry1 and Vip3A proteins, as well as to determine if there is any interaction between these proteins on the control of the two species. Bioassays with both isolated and combined proteins were carried out, and lethal concentrations LC50 and LC90 were estimated for each condition. Cry1Aa, Cry1Ac, and Vip3Af were the more effective proteins for the control of A. gemmatalis, while Cry1Ac, Vip3Aa, and Vip3Af were more effective for the control of C. includens. Cry1Ac and Cry1Ca proteins caused the highest inhibition to the development of larvae that survived the LC50 dose in both species. Different combinations of Vip3A and Cry1 have synergistic effect in the control of both species, and the combination Vip3Aa + Cry1Ea showed an outstanding control of A. gemmatalis and C. includens. These proteins are promising for building pyramided plants for the simultaneous control of the pests.O objetivo deste trabalho foi avaliar a suscetibilidade das lagartas Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) às proteínas Cry1 e Vip3A, bem como determinar se há a interação entre essas proteínas no controle das duas espécies. Bioensaios com as proteínas isoladas e em combinações foram realizados, e as concentrações letais CL50 e CL90 foram estimadas para cada condição. As proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Vip3Af foram as mais efetivas no controle de A. gemmatalis, enquanto Cry1Ac, Vip3Aa e Vip3Af foram mais efetivas no de C. includens. As proteínas Cry1Ac e Cry1Ca causaram maior inibição do desenvolvimento das larvas sobreviventes à CL50, em ambas as espécies. Combinações entre Vip3A e Cry1 apresentam efeito sinérgico no controle das espécies e a combinação Vip3Aa+Cry1Ea destaca-se no controle de A. gemmatalis e C. includens. Essas proteínas combinadas são promissoras na construção de plantas piramidadas, para o controle simultâneo das pragas

Identification and characterization of coleoptera‑specific vip and cry genes in Bacillus thuringiensis isolates

O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os genes cry3, vip1, vip2 e vip1/vip2 em uma coleção de 1.078 isolados de Bacillus thuringiensis potencialmente tóxicos para larvas de coleópteros. Foram utilizados pares de oligonucleotídeos iniciadores gerais obtidos a partir de regiões conservadas dos genes e do alinhamento de sequências consenso. Posteriormente, os isolados positivos foram caracterizados por meio da técnica de PCR‑RFLP, tendo‑se utilizado enzimas de restrição específicas, para identificar novas subclasses de genes nos isolados. Cento e cinquenta e um isolados foram positivos para os genes avaliados, com maior frequência para o gene vip1/vip2 (139 isolados). Pela técnica de PCR-RFLP, foram observados 14 perfis polimórficos, o que indica a presença de diferentes alelos e, consequentemente, de distintas subclasses desses genes.The objective of this work was to identify and characterize cry3, vip1, vip2 and vip1/vip2 genes in a collection of 1,078 Bacillus thuringiensis isolates potentially toxic against Coleoptera larvae. Pairs of primers derived from conserved regions of genes and from sequence alignment consensus were used. Subsequently, positive isolates were characterized by PCR‑RFLP, using specific restriction enzymes to identify new subclasses of genes in the isolates. One hundred and fifty‑one isolates were positive for the evaluated genes, with higher frequency for the vip1/vip2 gene (139  isolates). By PCR‑RFLP,  14  polymorphic profiles were  observed, indicating the presence of different alleles, and, therefore, of distinct subclasses of these genes