IGF-1 Regulates the extracellular level of active MMP-2 and promotes Müller glial cell motility

In ischemic proliferative retinopathies, Müller glial cells (MGCs) acquire migratory abilities. However, the mechanisms that regulate this migration remain poorly understood. In addition, proliferative disorders associated with enhanced activities of matrix metalloproteinases (MMPs) also involve insulin-like growth factor (IGF)-1 participation. Therefore, the main interest of this work was to investigate the IGF-1 effect on the extracellular proteolytic activity in MGCs.Methods: Cell culture supernatants and cell lysates of the human MGC line MIO-M1 stimulated with IGF-1 were analyzed for MMP-2 by zymographic and Western blot analysis. The MGCs´ motility was evaluated by scratch wound assay. The MMP-2, β1-integrin, and focal adhesions were detected by confocal microscopy. The localization of active MMPs and actin cytoskeleton were evaluated by in situ zymography.Results: The IGF-1 induced the activation of canonical signaling pathways through the IGF-1R phosphorylation. Culture supernatants showed a relative decrease in the active form of MMP-2, correlating with an increased accumulation of MMP-2 protein in the MGCs´ lysate. The IGF-1 effect on MMP-2 was abolished by an IGF-1R blocking antibody, αIR3, as well as by the PI3-kinase inhibitor, LY294002. The IGF-1 increased the migratory capacity of MGCs, which was blocked by the GM6001 MMP inhibitor, LY294002 and αIR3. Finally, IGF-1 induced the intracellular distribution of MMP-2 toward cellular protrusions and the partial colocalization with β1-integrin and phospo-focal adhesion kinase signals. Gelatinase activity was concentrated along F-actin filaments.Conclusions: Taken together, these data indicate that IGF-1, through its receptor activation, regulates MGCs´ motility by a mechanism that involves the MMP-2 and PI3K signaling pathway.Fil: Lorenc, Valeria Erika. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Luna Pinto, Jose Domingo. Departamento de Vítreo-retina, Centro Privado de Ojos R; ArgentinaFil: Chiabrando, Gustavo Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Sanchez, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentin

Activated α2-Macroglobulin regulates LRP1 levels at the plasma membrane through the activation of a Rab10-dependent exocytic pathway in retinal Müller glial cells

Activated α2-macroglobulin (α2M*) and its receptor, low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1), have been linked to proliferative retinal diseases. In Müller glial cells (MGCs), the α2M*/LRP1 interaction induces cell signaling, cell migration, and extracellular matrix remodeling, processes closely associated with proliferative disorders. However, the mechanism whereby α2M* and LRP1 participate in the aforementioned pathologies remains incompletely elucidated. Here, we investigate whether α2M* regulates both the intracellular distribution and sorting of LRP1 to the plasma membrane (PM) and how this regulation is involved in the cell migration of MGCs. Using a human Müller glial-derived cell line, MIO-M1, we demonstrate that the α2M*/LRP1 complex is internalized and rapidly reaches early endosomes. Afterward, α2M* is routed to degradative compartments, while LRP1 is accumulated at the PM through a Rab10-dependent exocytic pathway regulated by PI3K/Akt. Interestingly, Rab10 knockdown reduces both LRP1 accumulation at the PM and cell migration of MIO-M1 cells induced by α2M*. Given the importance of MGCs in the maintenance of retinal homeostasis, unravelling this molecular mechanism can potentially provide new therapeutic targets for the treatment of proliferative retinopathies.Fil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. University of Toronto; Canadá. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba; ArgentinaFil: Actis Dato, Virginia. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Díaz, Nicolás Maximiliano. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Sánchez, María C.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba; ArgentinaFil: Barcelona, Pablo Federico. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Chiabrando, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentin

Dynamic glucose uptake, storage, and release by human microvascular endothelial cells

Endothelia determine blood-to-tissue solute delivery, yet glucose transit is poorly understood. To illuminate mechanisms, we tracked [3H]-2-deoxyglucose (2-DG) in human adipose-tissue microvascular endothelial cells. 2-DG uptake was largely facilitated by the glucose transporters GLUT1 and GLUT3. Once in the cytosol, >80% of 2-DG became phosphorylated and ∼20% incorporated into glycogen, suggesting that transported glucose is readily accessible to cytosolic enzymes. Interestingly, a fraction of intracellular 2-DG was released over time (15–20% over 30 min) with slower kinetics than for uptake, involving GLUT3. In contrast to intracellular 2-DG, the released 2-DG was largely unphosphorylated. Glucose release involved endoplasmic reticulum–resident translocases/phosphatases and was stimulated by adrenaline, consistent with participation of glycogenolysis and glucose dephosphorylation. Surprisingly, the fluorescent glucose derivative 2-NBD-glucose (2-NBDG) entered cells largely via fluid phase endocytosis and exited by recycling. 2-NBDG uptake was insensitive to GLUT1/GLUT3 inhibition, suggesting poor influx across membranes. 2-NBDG recycling, but not 2-DG efflux, was sensitive to N-ethyl maleimide. In sum, by utilizing radioactive and fluorescent glucose derivatives, we identified two parallel routes of entry: uptake into the cytosol through dedicated glucose transporters and endocytosis. This reveals the complex glucose handling by endothelial cells that may contribute to glucose delivery to tissues.Fil: Yazdani, Samaneh. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Bilan, Philip J.. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Salta. Instituto de Patología Experimental. Universidad Nacional de Salta. Facultad de Ciencias de la Salud. Instituto de Patología Experimental; Argentina. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Pang, Janice. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Ceban, Felicia. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Saran, Ekambir. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Brumell, John H.. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; Canadá. University of Toronto; CanadáFil: Freeman, Spencer A.. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; Canadá. University of Toronto; CanadáFil: Klip, Amira. University of Toronto; Canadá. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; Canad

Aspectos moleculares y celulares de la interacción de ɑ2-macroglobulina con su receptor específico LRP1 : implicancias en la migración celular /

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014La α2-Macroglubilina (α2M) y su receptor específico LRP1 (del inglés low density lipoprotein receptor-related protein 1) tienen una activa participación en la remodelación de la matriz extracelular (MEC) así como también en la migración y la proliferación celular. La α2M, a través de su acción inhibitoria sobre un amplio espectro de proteasas, actúa como reguladora de la proteólisis extracelular. Si bien se conoce que el complejo α2M-proteasa (α2M*) se une a LRP1, es internalizado a través de un mecanismo de endocitosis mediado por clatrina y degradado en lisosomas, al presente no ha sido completamente esclarecido a qué nivel de su ruta de internalización se disocia de LRP1, así como tampoco qué tipo de reciclado endocítico sigue este receptor luego de la disociación. El estudio del transporte intracelular de α2M* y LRP1 es clave para el entendimiento de las diversas acciones celulares que cumple este sistema molecular, principalmente en lo que respecta a la activación de las vías de transducción de señales. Por otra parte, se conoce que la interacción α2M*/LRP1 regula la actividad de las metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP-2 y MT1-MMP, las cuales participan activamente en los procesos migratorios y de formación de lamelipodios en células gliales de Müller retinales. No obstante, aún restan dilucidar cuáles son los mecanismos moleculares y celulares que regulan la actividad de estas MMP a nivel de la superficie celular. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo de tesis fue investigar aspectos moleculares y celulares de la interacción de α2M* con su receptor específico LRP1. Dentro de este marco general se pretendió dilucidar si α2M* cumple algún rol en la regulación del transporte intracelular de LRP1, así como también en la inducción de la migración celular. Para ello se abordaron los siguiente objetivos específicos: 1) investigar el transporte intracelular de α2M* y LRP1, caracterizando a) la ruta de internalización de α2M*, b) la distribución y localización subcelular de LRP1 en presencia de α2M*, y c) el reciclado endocítico y/o la exocitosis de LRP1 desde vesículas intracelulares hacia la membrana plasmática; y 2) evaluar mecanismos moleculares y celulares por los que α2M* induce el incremento de la migración celular. De este modo, este trabajo de tesis presenta una nueva perspectiva en el estudio bioquímico y celular de la participación de α2M y LRP1 en el control de la proteólisis extracelular y la activación del componente celular implicado en la remodelación de la MEC. Estos eventos tienen lugar durante la progresión de diversos procesos fisiológicos y patológicos, tales como la angiogénesis y la retinopatía isquémica proliferativa (entre otras, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía del prematuro y retinopatía asociada a anemia falciforme). Como modelo experimental se utilizó la línea de células gliales de Müller aisladas de retinas humanas y espontáneamente inmortalizadas, MIO-M1, las cuales expresan de manera constitutiva el receptor LRP1. Mediante la realización de ensayos de microscopía confocal se caracterizó el transporte intracelular de α2M* y LRP1 en células MIO-M1. Se observó que α2M* siguió una ruta de internalización a través de endosomas de sorting y endosomas tardíos, la cual culminó con su degradación en lisosomas, a diferencia de lo observado para LRP1, el cual no se detectó en compartimentos de degradación. Además, luego del estímulo con α2M*, el nivel de LRP1 en la membrana plasmática incrementó significativamente, lo cual fue evidenciado mediante microscopía TIRF, citometría de flujo y ensayos de biotinilación de proteínas de membrana plasmática seguidos de inmunoprecipitación. Cabe destacar que la expresión de una dominante negativa de la proteína motora intracelular con actividad GTPasa Rab11 (Rab11S25N-GFP), en células MIO-M1, no impidió el incremento de LRP1 en la superficie celular luego del estímulo con su ligando. Por otro lado, mediante el uso de ensayos de migración en la herida y zimografía, se demostró que α2M* indujo el incremento de la motilidad celular y la activación de proMMP-2 en células MIO-M1. Estos procesos fueron bloqueados cuando LRP1 y MT1-MMP se silenciaron con técnicas de siRNA y shRNA. Por otra parte, mediante el uso de microscopía confocal y procedimientos bioquímicos, se observó que α2M* indujo la acumulación de LRP1 y MT1-MMP en endosomas de sorting, seguido por el reciclado endocítico y la redistribución intracelular de MT1-MMP en las protuberancias celulares. Además, el uso de Rab11S25N-GFP inhibió el reciclado endocítico de MT1-MMP, la migración celular y la activación de proMMP-2 inducida por α2M*. En conclusión, la interacción α2M*/LRP1 indujo la migración de células gliales de Müller por un mecanismo dependiente de Rab11, el cual involucra el transporte intracelular de MT1-MMP a la membrana plasmática.Jaldín Fincati, Javier Roberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Chiabrando, Gustavo Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina.Politi, Luis Enrique. Universidad Nacional del Sur. Investigación y desarrollo en Modelado, Identificación y Control de Sistemas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Activated α2-macroglobulin induces Müller glial cell migration by regulating MT1-MMP activity through LRP1

In retinal proliferative diseases, Müller glial cells (MGCs) acquire migratory abilities. However, the mechanisms that regulate this migration remain poorly understood. In addition, proliferative disorders associated with enhanced activities of matrix metalloprotease 2 (MMP-2) and MMP-9 also present increased levels of the protease inhibitor α2-macroglobulin (α2M) and its receptor, the low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1). In the present work, we investigated whether the protease activated form of α2M, α2M*, and LRP1 are involved with the MGC migratory process. By performing wound-scratch migration and zymography assays, we demonstrated that α2M* induced cell migration and proMMP-2 activation in the human Müller glial cell line, MIO-M1. This induction was blocked when LRP1 and MT1-MMP were knocked down with siRNA techniques. Using fluorescence microscopy and biochemical procedures, we found that α2M* induced an increase in LRP1 and MT1-MMP accumulation in early endosomes, followed by endocytic recycling and intracellular distribution of MT1-MMP toward cellular protrusions. Moreover, Rab11-dominant negative mutant abrogated MT1-MMP recycling pathway, cell migration, and proMMP-2 activation induced by α2M*. In conclusion, α2M*, through its receptor LRP1, induces cellular migration of Müller glial cells by a mechanism that involves MT1-MMP intracellular traffic to the plasma membrane by a Rab11-dependent recycling pathway.—Barcelona, P. F., Jaldín-Fincati, J. R., Sánchez, M. C., Chiabrando, G. A. Activated α2-macroglobulin induces Müller glial cell migration by regulating MT1-MMP activity through LRP1.Fil: Barcelona, Pablo Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Sanchez, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Chiabrando, Gustavo Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentin

Update on GLUT4 Vesicle Traffic: A Cornerstone of Insulin Action

Glucose transport is rate limiting for dietary glucose utilization by muscle and fat. The glucose transporter GLUT4 is dynamically sorted and retained intracellularly and redistributes to the plasma membrane (PM) by insulin-regulated vesicular traffic, or ‘GLUT4 translocation’. Here we emphasize recent findings in GLUT4 translocation research. The application of total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) has increased our understanding of insulin-regulated events beneath the PM, such as vesicle tethering and membrane fusion. We describe recent findings on Akt-targeted Rab GTPase-activating proteins (GAPs) (TBC1D1, TBC1D4, TBC1D13) and downstream Rab GTPases (Rab8a, Rab10, Rab13, Rab14, and their effectors) along with the input of Rac1 and actin filaments, molecular motors [myosinVa (MyoVa), myosin1c (Myo1c), myosinIIA (MyoIIA)], and membrane fusion regulators (syntaxin4, munc18c, Doc2b). Collectively these findings reveal novel events in insulin-regulated GLUT4 traffic. Insulin promotes GLUT4 redistribution from recycling endosomes and specialized intracellular compartments to the plasma membrane (PM). Signaling bifurcates downstream of phosphatidylinositol 3-kinase towards Akt and Rac. Akt signaling leads to activation of Rab10 in adipocytes and Rab8a and Rab13 in myoblasts. Rab10 acts at several steps in GLUT4 translocation, whereas Rab8a promotes GLUT4 exit from the perinuclear region and Rab13 promotes tethering of GLUT4 vesicles near the PM. Rac1 signaling induces cortical actin remodeling that tethers GLUT4 vesicles beneath the PM. Additional proteins may also fine-tune actin remodeling through tropomyosin3.1 and tropomodulin3 via Akt2 input. Insulin increases [Ca2+] beneath the PM, which may regulate the SNARE complex that mediates the final step of GLUT4 vesicle fusion with the PM.Fil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Pavarotti, Martin Alejandro. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; Canadá. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mendoza. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Cienicas Médicas. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza Dr. Mario H. Burgos; ArgentinaFil: Frendo-Cumbo, Scott. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Bilan, Philip J.. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; CanadáFil: Klip, Amira. University Of Toronto. Hospital For Sick Children; Canadá. University of Toronto; Canad

Activated α2-Macroglobulin Induces Mesenchymal Cellular Migration Of Raw264.7 Cells Through Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1

Distinct modes of cell migration contribute to diverse types of cell movements. The mesenchymal mode is characterized by a multistep cycle of membrane protrusion, the formation of focal adhesion, and the stabilization at the leading edge associated with the degradation of extracellular matrix (ECM) components and with regulated extracellular proteolysis. Both α2-Macroglobulin (α2M) and its receptor, low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1), play important roles in inflammatory processes, by controlling the extracellular activity of several proteases. The binding of the active form of α2M (α2M*) to LRP1 can also activate different signaling pathways in macrophages, thus inducing extracellular matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) activation and cellular proliferation. In the present study, we investigated whether the α2M*/LRP1 interaction induces cellular migration of the macrophage-derived cell line, Raw264.7. By using the wound-scratch migration assay and confocal microscopy, we demonstrate that α2M* induces LRP1-mediated mesenchymal cellular migration. This migration exhibits the production of enlarged cellular protrusions, MT1-MMP distribution to these leading edge protrusions, actin polymerization, focal adhesion formation, and increased intracellular LRP1/β1-integrin colocalization. Moreover, the presence of calphostin-C blocked the α2M*-stimulated cellular protrusions, suggesting that the PKC activation is involved in the cellular motility of Raw264.7 cells. These findings could constitute a therapeutic target for inflammatory processes with deleterious consequences for human health, such as rheumatoid arthritis, atherosclerosis and cancer. J. Cell. Biochem. 118: 1810?1818, 2017.Fil: Ferrer, Dario German. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; ArgentinaFil: Actis Dato, Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; ArgentinaFil: Jaldín Fincati, Javier Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. University Johns Hopkins; Estados UnidosFil: Lorenc, Valeria Erika. University Johns Hopkins; Estados Unidos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; ArgentinaFil: Sanchez, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; ArgentinaFil: Chiabrando, Gustavo Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentin