Intéractions avec le ribosome et changements conformationnels de la GTPase bactérienne EngA, une cible potentielle pour de nouveaux antibiotiques

The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway.Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours

Additional file 2: of New insights into the phylogenetics and population structure of the prairie falcon (Falco mexicanus)

Figure S1. Paired-end read coverage of 2181 scaffolds. Sequencing depth is on the x-axis while the y-axis shows the percentage of total bases at a given depth. Reads were aligned to the genome using BWA. (PDF 156 kb

Additional file 3: of New insights into the phylogenetics and population structure of the prairie falcon (Falco mexicanus)

Table S2. Top Pfam domain hits in the F. mexicanus genome and their counts. (PDF 175 kb

Additional file 4: of New insights into the phylogenetics and population structure of the prairie falcon (Falco mexicanus)

Figure S2. The F. mexicanus mitochondrial genome map. COX1, COX2 and COX3 indicate cytochrome oxidase subunits 1–3; CYTB indicates cytochrome b; atp6 and atp8 indicate ATPase subunits 6 and 8; ND1–ND6 indicate NADH dehydrogenase subunits 1–6. Transfer RNA genes are designated by single-letter amino acid codes. (PDF 192 kb

Additional file 6: of New insights into the phylogenetics and population structure of the prairie falcon (Falco mexicanus)

Figure S4. Results of LOSITAN and BAYESCAN analyses. a) The confidence area for candidate loci under positive selection is shown in red. LOSITAN identified two outlier loci: X1613239_349604 (CACNA1G) and X1613580_160905 (A2ML1). b) No outlier loci were detected via BAYESCAN analysis. Posterior odds are plotted on the x axis and FST index values on the y axis. (PDF 36 kb

Additional file 7: of New insights into the phylogenetics and population structure of the prairie falcon (Falco mexicanus)

Table S3. Locus-specific pairwise FST values for prairie falcons in the San Francisco East Bay Area (East Bay), Pinnacles National Park (Pinnacles), the Mojave Desert (Mojave) and Idaho. (PDF 281 kb