The role of MgATP in nitrogenase catalysis

Naast water bepaalt de hoeveelheid stikstof die in de bodem aanwezig is in de meeste gevallen de produktiviteit van de landbouwgebieden op aarde. Het is van belang dat stikstof in een voor de plant bruikbare vorm beschikbaar is. op het eerste gezicht lijkt het vreemd dat er een tekort aan stikstof kan optreden, omdat 80% van de lucht om ons heen uit stikstofgas bestaat. Maar voor nagenoeg alle vormen van leven is de stikstof zoals die in de lucht voorkomt, namelijk als het molekuul N 2 , niet bruikbaar. Planten en de meeste mikroorganismen verkrijgen hun stikstof in het algemeen uit verbindingen zoals ammonia (NH 3 ) en nitraat (NO 3 ). Dieren verkrijgen de stikstof die ze nodig hebben om te kunnen groeien en funktioneren door het eten van planten en andere dieren. De reden waarom elk levend wezen stikstof nodig heeft is gelegen in het feit dat twee van de meest essentiële bestanddelen van de cel stikstof bevatten, namelijk eiwitten en nucleïnezuren (DNA, RNA). Slechts een beperkt aantal mikroorganismen is in staat om stikstofgas uit de lucht (N 2 ) om te zetten in ammonia. Dit proces noemt men stikstofbinding. Ammonia wordt als N-bron gebruikt voor de synthese van stikstofhoudende verbindingen. De stikstofbindende bakteriën komen in allerlei vormen voor, maar de belangrijkste voor de landbouw zijn die bakteriën die in de wortelknolletjes van vlinderbloemige planten leven in symbiose met de plant. Zonder de wetenschappelijke achtergrond te kennen maakten de Romeinen reeds gebruik van zogenaamde wisselbouw, dit wil zeggen, door het afwisselend verbouwen van vlinderbloemige gewassen als klaver en erwteplanten en niet-vlinderbloemige gewassen zoals graan, werd de vruchtbaarheid van de bodem op peil gehouden. Het duurde echter nog tot in de 19e eeuw voordat ontdekt werd dat wortelknollen bakteriën bevatten die stikstof uit de lucht om kunnen zetten in een stikstofverbinding die door de plant gebruikt kan worden.In de huidige, intensieve landbouwgebieden wordt voor een belangrijk deel gebruik gemaakt van (stikstof) kunstmest om aan de stikstofbehoefte van de plant te kunnen voldoen. De Industriële produktie van kunstmest gebeurt volgens het Haber-Bosch proces: uitgaande van de grondstoffen N 2 en H 2 wordt bij hoge druk (350-1000 atmosfeer) en een hoge temperatuur (±350°C) ammonia gevormd In aanwezigheid van een ijzer bevattende katalysator. Door de hoge energiekosten die gepaard gaan met dit proces, evenals de hoge investeringskosten die nodig zijn voor het opzetten van een kunstmestfabriek (het is alleen grootschalig ekonomisch uit te voeren) en de noodzaak van opslag en transport van het geproduceerde kunstmest, is de produktie van kunstmest en dus het gebruik ervan in de landbouw voor de meeste ontwikkelingslanden ekonomisch niet haalbaar. Om het toenemende aantal mensen op deze wereld van voedsel te kunnen voorzien is het echter nodig dat de landbouwproduktie toeneemt. Dit houdt in dat ook de stikstofgift aan de bodem drastisch moet stijgen. Aangezien de huidige methoden van kunstmestproduktie gebruik maken van niet onuitputtelijke bronnen van energie (fossiele brandstoffen), is het belangrijk dat onderzoek gedaan wordt met als doel de biologische stikstoffixatie te verbeteren, zodat het gebruik van kunstmest beperkt kan blijven. Biologische stikstofbinding is een proces dat gedreven wordt door een onuitputtelijke energiebron namelijk zonlicht. Bovendien wordt het biologisch gebonden stikstof efficiënt gebruikt en spoelt niet direkt uit.Het enzym, dat in stikstofbindende bakteriën de omzetting van N 2 in NH 3 katalyseert noemt men nitrogenase. Het in dit proefschrift beschreven onderzoek heeft zich voornamelijk gericht op het werkingsmechanisme van dit enzym. Omdat de eigenschappen van nitrogenase uit de verschillende soorten stikstofbindende bakteriën nauwelijks verschillen, en omdat de bakterie Azotobactervinelandii gemakkelijk op grote schaal gekweekt kan worden, zijn de in dit proefschrift beschreven eksperimenten uitgevoerd met nitrogenase uit deze bakterie. Tijdens de zuivering van nitrogenase wordt het enzym in twee komponenten gescheiden, vaak aangeduid met komponent 1 en komponent 2. Beide komponenten zijn nodig voor de omzetting van N 2 in NH 3 . Verder zijn er voor de reduktie van N 2 tot NH 3 , ATP en een sterk reduktiemiddel nodig.In het Haber-Bosch proces wordt de energie die nodig is om het inert N 2 molekuul te reduceren geleverd door een hoge temperatuur. Daarentegen vindt de omzetting van N 2 in NH 3 door het enzym nitrogenase plaats bij kamertemperatuur. ATP is hierbij de leverancier van de benodigde energie. ATP is een in de cel voorkomende energierijke verbinding. Deze vastgelegde energie kan gebruikt worden in energie vereisende reakties. Hierbij wordt een fosfaatgroep afgesplitst en ontstaat er ADP. Voor de omzetting van één molekuul N 2 in twee molekulen NH 3 is de hydrolyse van 16 molekulen ATP nodig. De omzetting van N 2 in NH 3 , en ook de hydrolyse van ATP, treedt alleen op wanneer beide komponenten van nitrogenase aanwezig zijn. De afzonderlijke komponenten kunnen geen ATP hydrolyseren.In de hoofdstukken 2 en 3 staan de eigenschappen beschreven van de binding van ATP en ADP aan komponent 2. Komponent 1 bindt geen adenine nukleotiden. De elektronen die nodig zijn voor de omzetting van N 2 in NH 3 worden via komponent 2 naar komponent 1 getransporteerd. Men neemt aan dat de substraat reduktie plaatsvindt op komponent 1 van nitrogenase. De hydrolyse van ATP tijdens de nitrogenase reaktie vindt plaats wanneer een elektron wordt overgedragen van komponent 2 naar komponent 1. Omdat er geen elektronen-overdracht plaatsvindt in afwezigheid van ATP, wordt aangenomen dat de ATP hydrolyse nodig is voor deze elektronen-overdrachtsreaktie. In hoofdstuk 4 wordt aangetoond dat nitrogenase ook ATP hydrolyseert wanneer er geen elektronen-overdracht tussen beide komponenten plaatsvindt. Dit was een eerste aanwijzing dat de ATP hydrolyse mogelijk nog een andere funktie heeft behalve een direkte deelname in de elektronenoverdrachtsreaktie. Een tweede aanwijzing werd verkregen uit eksperimenten waarin aangetoond werd dat, alhoewel komponent 2 slechts twee bindingsplaatsen bezit voor ATP, er vier molekulen ATP binnen 60 millisekonden gehydrolyseerd worden door het nitrogenase kompleks. Dit suggereert dat er twee ekstra ATP bindingsplaatsen ontstaan, wanneer komponent 1 en komponent 2 een kompleks vormen. Deze ATP's zouden mogelijk rechtstreeks betrokken kunnen zijn bij de omzetting van N 2 in NH 3 op komponent 1.In hoofdstuk 5 wordt verder Ingegaan op de betrokkenheid van ATP in de nitrogenase reaktie. In het huidige model wordt aangenomen dat de langzaamste stap van de nitrogenase katalyse de snelheid is waarmee het nitrogenase kompleks verplicht moet dissociëren na de overdracht van elektronen van komponent 2 naar komponent 1. De eksperimenten beschreven in hoofdstuk 5 suggereren dat de snelheidsbepalende reaktiestap onder bepaalde kondities anders is, namelijk de dissociatiesnelheid van ADP van Av 2 .Omdat een aantal kenmerken van de ATP hydrolyse door nitrogenase terug te vinden zijn in die van een ander eiwit dat ATP hydrolyseert/synthetiseert, de zogenaamde proton ATPase, worden in hoofdstuk 6 de mogelijke overeenkomsten tussen beide eiwitten wat betreft het mechanisme van ATP hydrolyse bediskussieerd.</p

Leertechnologie in de lage landen

Op het terrein van onderwijs en ICT investeren onderwijsinstellingen, bedrijven, brancheorganisaties en overheden in het bewerkstelligen van leertechnologie-afspraken. Het doel van die gezamenlijke inspanning is om het onderwijs te kunnen verbeteren en efficiënter te maken. Gedeelde opvattingen, vastgelegd in specificaties en standaarden, maken uitwisseling van gegevens mogelijk tussen uiteenlopende systemen. Dat biedt grote kansen voor onderwijsvernieuwing. Basisgegevens hoeven slechts op één plek onderhouden te worden, maar zijn toch voor iedere instelling bruikbaar: eenmaal gemaakte lesmaterialen kunnen in verschillende leeromgevingen worden ingezet, studenten kunnen zich flexibel inschrijven voor cursussen aan verschillende instellingen terwijl hun studievoortgang zonder probleem wordt geregistreerd. Deze processen zijn essentiële voorwaarden voor een duurzame ontwikkeling van e-learning in de Lage Landen. Als samenwerkingsorganisatie voor het hoger onderwijs in Nederland neemt SURF deel aan de mars naar standaardisatie binnen de leertechnologie. De SURF SiX expertisegroep, een Special Interest Group van SURF, onderneemt activiteiten om realisatie en gebruik van leertechnologie-afspraken te bevorderen die voor het Nederlandse hoger onderwijs bruikbaar en nuttig zijn en die blijvende aansluiting van Nederland bij internationale e-learningontwikkelingen garanderen. Met dit boek geeft SURF SiX een brede groep onderwijsontwikkelaars en geïnformeerde eindgebruikers inzicht in de huidige Nederlandse situatie op het gebied van leertechnologie-afspraken. Daarnaast wil dit boek laten zien dat leertechnologiespecificaties en standaarden meerwaarde hebben.Stichting Sur

IgE Cross-Reactivity of Cashew Nut Allergens

Background: Allergic sensitisation towards cashew nut often happens without a clear history of eating cashew nut. IgE cross-reactivity between cashew and pistachio nut is well described; however, the ability of cashew nut-specific IgE to cross-react to common tree nut species and other Anacardiaceae, like mango, pink peppercorn, or sumac is largely unknown. Objectives: Cashew nut allergic individuals may cross-react to foods that are phylogenetically related to cashew. We aimed to determine IgE cross-sensitisation and cross-reactivity profiles in cashew nut-sensitised subjects, towards botanically related proteins of other Anacardiaceae family members and related tree nut species. Method: Sera from children with a suspected cashew nut allergy (n = 56) were assessed for IgE sensitisation to common tree nuts, mango, pink peppercorn, and sumac using dot blot technique. Allergen cross-reactivity patterns between Anacardiaceae species were subsequently examined by SDS-PAGE and immunoblot inhibition, and IgE-reactive allergens were identified by LC-MS/MS. Results: From the 56 subjects analysed, 36 were positive on dot blot for cashew nut (63%). Of these, 50% were mono-sensitised to cashew nuts, 19% were co-sensitised to Anacardiaceae species, and 31% were co-sensitised to tree nuts. Subjects co-sensitised to Anacardiaceae species displayed a different allergen recognition pattern than subjects sensitised to common tree nuts. In pink peppercorn, putative albumin- and legumin-type seed storage proteins were found to cross-react with serum of cashew nut-sensitised subjects in vitro. In addition, a putative luminal binding protein was identified, which, among others, may be involved in cross-reactivity between several Anacardiaceae species. Conclusions: Results demonstrate the in vitro presence of IgE cross-sensitisation in children towards multiple Anacardiaceae species. In this study, putative novel allergens were identified in cashew, pistachio, and pink peppercorn, which may pose factors that underlie the observed cross-sensitivity to these species. The clinical relevance of this widespread cross-sensitisation is unknown.</p

Microtubule configurations and nuclear DNA synthesis during initiation of suspensor-bearing embryos from Brassica napus cv. Topas microspores

In the new Brassica napus microspore culture system, wherein embryos with suspensors are formed, ab initio mimics zygotic embryogenesis. The system provides a powerful in vitro tool for studying the diverse developmental processes that take place during early stages of plant embryogenesis. Here, we studied in this new culture system both the temporal and spatial distribution of nuclear DNA synthesis places and the organization of the microtubular (MT) cytoskeleton, which were visualized with a refined whole mount immunolocalization technology and 3D confocal laser scanning microscopy. A ‘mild’ heat stress induced microspores to elongate, to rearrange their MT cytoskeleton and to re-enter the cell cycle and perform a predictable sequence of divisions. These events led to the formation of a filamentous suspensor-like structure, of which the distal tip cell gave rise to the embryo proper. Cells of the developing pro-embryo characterized endoplasmic (EMTs) and cortical microtubules (CMTs) in various configurations in the successive stages of the cell cycle. However, the most prominent changes in MT configurations and nuclear DNA replication concerned the first sporophytic division occurring within microspores and the apical cell of the pro-embryo. Microspore embryogenesis was preceded by pre-prophase band formation and DNA synthesis. The apical cell of the pro-embryo exhibited a random organization of CMTs and, in relation to this, isotropic expansion occurred, mimicking the development of the apical cell of the zygotic situation. Moreover, the apical cell entered the S phase shortly before it divided transversally at the stage that the suspensor was 3–8 celled

Effect of starch-based biomaterials on the in vitro proliferation and viability of osteoblast-like cells

The cytotoxicity of starch-based polymers was investigated using different methodologies. Poly-L-lactic acid (PLLA) was used as a control for comparison purposes. Extracts of four different starch-based blends (corn starch and ethylene vinyl alcohol (SEVA-C), corn starch and cellulose acetate (SCA), corn starch and polycaprolactone (SPCL) and starch and poly-lactic acid (SPLA70) were prepared in culture medium and their toxicity was analysed. Osteoblast-like cells (SaOs-2) were incubated with the extracts and cell viability was assessed using the MTT test and a lactate dehydrogenase (LDH) assay. In addition DNA and total protein were quantified in order to evaluate cell proliferation. Cells were also cultured in direct contact with the polymers for 3 and 7 days and observed in light and scanning electron microscopy (SEM). LDH and DNA quantification revealed to be the most sensitive tests to assess respectively cell viability and cell proliferation after incubation with starch-based materials and PLLA. SCA was the starch blend with higher cytotoxicity index although similar to PLLA polymer. Cell adhesion tests confirmed the worst performance of the blend of starch with cellulose acetate but also showed that SPCL does not perform as well as it could be expected. All the other materials were shown to present a comparable behaviour in terms of cell adhesion showing slight differences in morphology that seem to disappear for longer culture times. The results of this study suggest that not only the extract of the materials but also their three-dimensional form has to be biologically tested in order to analyse material-associated parameters that are not possible to consider within the degradation extract. In this study, the majority of the starch-based biomaterials presented very promising results in terms of cytotoxicity, comparable to the currently used biodegradable PLLA which might lead the biocompatibility evaluation of those novel biomaterials to other studies.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

Presence of celiac disease epitopes in modern and old hexaploid wheat varieties: wheat breeding may have contributed to increased prevalence of celiac disease

Gluten proteins from wheat can induce celiac disease (CD) in genetically susceptible individuals. Specific gluten peptides can be presented by antigen presenting cells to gluten-sensitive T-cell lymphocytes leading to CD. During the last decades, a significant increase has been observed in the prevalence of CD. This may partly be attributed to an increase in awareness and to improved diagnostic techniques, but increased wheat and gluten consumption is also considered a major cause. To analyze whether wheat breeding contributed to the increase of the prevalence of CD, we have compared the genetic diversity of gluten proteins for the presence of two CD epitopes (Glia-α9 and Glia-α20) in 36 modern European wheat varieties and in 50 landraces representing the wheat varieties grown up to around a century ago. Glia-α9 is a major (immunodominant) epitope that is recognized by the majority of CD patients. The minor Glia-α20 was included as a technical reference. Overall, the presence of the Glia-α9 epitope was higher in the modern varieties, whereas the presence of the Glia-α20 epitope was lower, as compared to the landraces. This suggests that modern wheat breeding practices may have led to an increased exposure to CD epitopes. On the other hand, some modern varieties and landraces have been identified that have relatively low contents of both epitopes. Such selected lines may serve as a start to breed wheat for the introduction of ‘low CD toxic’ as a new breeding trait. Large-scale culture and consumption of such varieties would considerably aid in decreasing the prevalence of CD