Immunogical and hematological profiles of sickle cell disease patients treated with allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

A doença falciforme (DF) é uma doença monogênica, uma das mais prevalentes no mundo, causada por uma mutação pontual na posição 6 do gene codificador da cadeia da ?-globina que resulta na produção da hemoglobina anormal S. Atualmente, a única forma de tratamento capaz de curar pacientes com DF é o transplante de células-tronco hematopoéticas (TCHT) alogênico. Porém, poucos trabalhos da literatura avaliaram os mecanismos de ação envolvidos nas diferentes respostas terapêuticas dos pacientes com DF ao TCHT alogênico. Além disso, embora o sistema imunológico tenha um papel central no TCTH, nenhum estudo correlacionou o padrão de reconstituição imunológica com o desenvolvimento da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) e com a permanência do enxerto nos pacientes transplantados. Assim, nesse trabalho, avaliamos os mecanismos de reconstituição hematológica e imunológica envolvidos na resposta terapêutica de pacientes com a DF submetidos ao TCTH alogênico. Para isso, amostras de sangue periférico de pacientes com DF tratados com o TCTH foram coletadas antes e em diversos períodos após o transplante (1 mês, 3, 6, 12, 24, 36, 48 e 60 meses). Em seguida, foram avaliados: a enxertia por meio da quantificação do quimerismo de células nucleadas; a porcentagem de hemoglobinas; a expressão de moléculas de adesão em eritrócitos e em reticulócitos; níveis plasmáticos de biomarcadores da DF; a expressão gênica diferencial de genes envolvidos com a resposta inflamatória; frequências e números absolutos de subpopulações linfocitárias e mieloides no sangue periférico; os níveis plasmáticos de biomarcadores da DECH. A maioria dos pacientes atingiu o quimerismo misto e se mantiveram quimeras mistas até 5 anos após o transplante. Dos 40 pacientes avaliados, 8 perderam o enxerto, 14 desenvolveram DECH aguda (DECHa) e 6 DECH crônica (DECHc). Todos pacientes que tiveram DECH aguda ou crônica desenvolveram os sintomas leves da doença e foram facilmente tratados. Após o TCTH, houve redução da resposta inflamatória crônica, da expressão de moléculas de adesão na superfície das células vermelhas (hemácias e reticulócitos), da frequência de reticulócitos e da porcentagem de hemoglobina S. Os pacientes que perderam o enxerto após o transplante apresentaram maior frequência de células supressoras derivadas da linhagem mieloide monocíticas (MDSC-M) 1 mês após o transplante, maior número de iNKT 3 meses após o transplante, menor número de células T CD8+PD-1+ exaustas 12 meses após o transplante e menor número de células T CD8+CD28-CD57+ 24 meses após o transplante, comparado aos pacientes que não perderam o enxerto. Também foi observado aumento de células T reguladoras (células T CD4+CD25hiGITR+, T CD8+CD28-CD57+ e T CD8+CD28-FOXP3+) após o transplante em pacientes que não perderam o enxerto, comparado ao pré-transplante. Além disso, pacientes com DECHa apresentaram aumento da concentração de IL-15, IL-22, CD25/IL2R?, April, HGF e ST2 após o transplante comparado ao pré-transplante. Pacientes que desenvolveram DECHa tiveram redução dos números de células T CD4+ e CD8+ exaustas, expressando PD-1, 1 mês após o TCTH e aumento de células iNKT 3 meses após o TCTH comparado aos pacientes que não tiveram DECH. Comparado ao pré-transplante, pacientes com DECHa tiveram expansão de MDSC-M e MDSC-G 1 mês após o transplante. Em conclusão, com base nas avaliações imunológicas e hematológicas realizadas, nosso trabalho demonstrou que o TCTH alogênico apresenta eficácia terapêutica em pacientes com DF. Além da melhora significativa do quadro inflamatório crônico, os pacientes com DF que não desenvolveram DECH e/ou não perderam o enxerto apresentaram uma expressiva expansão de células T reguladoras (células T CD4+CD25hiGITR+, T CD8+CD28-CD57+ e T CD8+CD28-FOXP3+) e de células T exaustas durante a reconstituição imunológica, sugerindo importante função dessas células no estabelecimento da tolerância imunológica duradoura após o TCTH alogênico nesses pacientes.Sickle cell disease (SCD) is a monogenic disease, one of the most prevalent in the world, caused by one point mutation at position 6 of the ?-globin gene, which results in abnormal production of hemoglobin S. Currently, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the only curative option available for patients with SCD. However, few studies have evaluated the mechanisms of action involved in different therapeutic responses of SCD patients treated with allogeneic HSCT. Additionally, although the immune system plays a central role in HSCT, there is no study correlating immune reconstitution patterns with the development of graft versus host disease (GVHD) and graft maintenance in SCD transplanted patients. Thus, in this work, we have evaluated the mechanisms of hematological and immunological reconstitution involved in therapeutic response of SCD patients submitted to allogeneic HSCT. For this purpose, peripheral blood samples from SCD patients treated with HSCT were collected before and at various periods after transplantation (1 month, 3, 6, 12, 24, 36, 48 and 60 months). Then, were have evaluated the: grafting by quantification the nucleated cells chimerism; percentage of hemoglobin; expression of adhesion molecules in erythrocytes and reticulocytes; plasma levels of SCD biomarkers; differential expression of genes associated with inflammatory response; frequencies and absolute numbers of lymphocyte and myeloid subpopulations in peripheral blood; and plasma levels of GVHD biomarkers. The majority of patients maintained mixed chimerism until 5 years after transplantation. Of the 40 patients evaluated, 8 had graft failure, 14 developed acute GVHD (aGVHD) and 6 had chronic GVHD (cGVHD). All patients with acute or chronic GVHD developed mild symptoms of the disease and were easily treated. The chronic inflammatory response, the expression of adhesion molecules on the red cell surface (mature red blood cells and reticulocytes), the reticulocyte frequency and the hemoglobin S percentage were decreased after HSCT. Patients with graft failure had higher frequency of monocytic myeloid-derived suppressor cells (MDSC-M) 1 month after transplantation, higher number of iNKT 3 months after transplantation, lower number of CD8+PD-1+ T cells 12 months after transplantation and lower number of CD8+CD28+CD57+ T cells 24 months after transplantation than grafted patients. Increased numbers of regulatory T cells (CD4+CD25hiGITR+, CD8+CD28-CD57+ and CD8+CD28-FOXP3+ T cells) were also observed after transplantation in grafted patients compared to pre-transplantation period. In addition, patients with aGVHD showed increased levels of IL-15, IL-22, CD25/IL2R?, April, HGF and ST2 after transplantation compared to baseline. Patients with aGVHD had lower numbers of exhausted CD4+PD-1+ and CD8+PD-1+ T cells 1 month after HSCT and higher numbers of iNKT cells 3 months after HSCT than non-GVHD patients. Patients with aGVHD had expansion of MDSC-M and MDSC-G at 1 month after transplantation compared to pre-transplantation period. In conclusion, based on the immunological and hematological evaluations, our study has demonstrated that allogeneic HSCT has therapeutic efficacy in patients with SCD. In addition to significant improvement in the chronic inflammatory condition, SCD patients without GVHD and/or without graft failure showed relevant expansions of regulatory T cells (CD4+CD25hiGITR+T cells, CD8+CD28-CD57+T cells and CD8+CD28+FOXP3+T cells) and exhausted T cells during immunological reconstitution process, suggesting an important role of these cells in establishing sustained immune tolerance state after allogeneic HSCT in these patients

Evaluation of thymic function in type 1 diabetes mellitus patients following autologous hematopoietic stem cell transplantation.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva das células pancreáticas produtoras de insulina. A imunossupressão em altas doses seguida do transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) constitui uma alternativa terapêutica recente e promissora para o DM-1 recém-diagnosticado, impedindo a progressão da destruição das células pancreáticas produtoras de insulina e induzindo independência insulínica por um período prolongado na maioria dos pacientes. O princípio dessa terapia baseia-se na eliminação das células autorreativas pela imunossupressão intensa e na reconstituição de um sistema imunológico novo e tolerante após o transplante. Com o objetivo de avaliar a função do timo e sua contribuição na geração do repertório de células T nos pacientes com DM-1 após o TACTH, nesse trabalho foram avaliados os níveis de T cell receptor excision circles (TRECs) em células T do sangue periférico e a diversidade do repertório de células T dos pacientes com DM-1 (n=23) antes e em diversos períodos após o transplante. A quantificação absoluta dos níveis de TRECs (número de moléculas de TRECs/100g de DNA) foi realizada pela técnica de PCR em tempo real e a avaliação do repertório de células T foi realizada pela técnica de TCRBV CDR3 Spectratyping. Dentre os vinte e três pacientes, vinte alcançaram a independência insulínica por períodos variáveis de tempo e três não responderam ao tratamento. Não foi observada a restrição do repertório de células T nos pacientes com DM-1 no período pré-transplante, ou seja, quando recém-diagnosticados. Foram identificadas cinco famílias V (7, 18, 19, 20 e 22) em expansão clonal nos pacientes com DM-1. As famílias V 7, 18, 19, 20 apresentaram-se em expansão clonal antes do transplante e se mantiveram com frequência elevada após o transplante, enquanto a família V 22 apresentou aumento da frequência somente nos períodos mais tardios após o transplante. Nos primeiros meses após o transplante, houve redução do número de moléculas de TRECs e restrição do repertório de células T. Contudo, um ano após o transplante, o número de moléculas de TRECs atingiram valores normais e o repertório de células T apresentou-se com ampla diversidade. Nossos resultados mostraram que o TACTH foi capaz de induzir mudanças na composição do repertório de células T dos pacientes com DM-1 após a terapia de IAD/TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 do TCR, sugerindo a reconstituição de um repertório de células T diverso até dois anos pós-transplante. Embora tenha ocorrido reativação da função tímica após o transplante, evidenciada pelo aumento dos níveis de TRECs de um ano e meio a cinco anos pós-transplante, a diversidade do repertório das células T diminuiu a partir de dois anos e meio pós-transplante, sugerindo uma reconstituição tímica de novo de células T naive que expressam preferencialmente algumas cadeias V. Estas evidências imunológicas poderiam explicar a melhora clínica (independência insulínica) temporária observada na maioria dos pacientes após a terapia de IAD/TACTH.Type 1 diabetes mellitus (T1D) is an organ-specific autoimmune disease characterized by insulin-producing pancreatic cell destruction. High-dose immunosuppression followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is a recent and promising therapeutic approach for treatment of T1D, preventing the progress of destruction of pancreatic cells and inducing insulin independence for a prolonged period in most patients. The rationale of the AHSCT is based on the elimination of autoreactive cells by the intense immunosuppression and on the reconstitution of a new and tolerant immune system after transplantation. Aiming at assessing the thymic role in the production of new T cell repertoire in T1D patients after AHSCT, in this study was evaluated the levels of T cell receptor excision circles (TRECs) in T cells of peripheral blood as well as the clonality and diversity of T cell repertoire in T1D patients (n=23) before and several periods after transplantation. The absolute quantification of TRECs levels (number of molecules of TRECs/100ng of DNA) was performed by real-time PCR and the analysis of T cell repertoire was performed by TCRBV CDR3 Spectratyping. Among the twenty-three patients, twenty achieved insulin independence for variable periods and three did not respond to the treatment. The T cell repertoire in T1D patients was not restricted in pre-transplantation, i.e., when newly diagnosed. It was identified five V families (7, 18, 19, 20 e 22) in the clonal expansion in T1D patients. The V families 7, 18, 19, 20 were in clonal expansion before transplantation and maintained with high frequency after transplantation, whereas the V 22 family increased its frequency only in the later periods after transplantation. It was observed that the numbers of molecules of TRECs decreased and the T cell repertoire was restricted in the early months after transplantation. However, the levels of TRECs were normalized and the T cell repertoire showed diversity one year after transplantation. Our results indicate that AHSCT was able to induce changes in the composition of the T cell repertoire of patients after AHSCT, evidenced by qualitative and quantitative changes in the composition of T-cell receptor -chain CDR3 peaks, suggesting the reconstitution of diverse T cell repertoire up to two years after transplantation. Although there was reactivation of thymic function after transplantation, as evidenced by increased levels of TRECs from one and a half year to five years after transplantation, the diversity of the T cells repertoire decreased from two and a half years after transplantation, suggesting a reconstruction of new naive T cells that preferentially express some V chains. These immunological evidences could explain the temporary clinical improvement (insulin independence) observed in most patients after IAD / AHSCT therapy