Padronização da técnica de cultura organotípica de hipocampo de rato para avaliação do efeito neuroprotetor da lectina Canavalia brasileiensis (ConBr) em um modelo in vitro de isquemia cerebral

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016.Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos presentes em glicoconjugados podendo regular diversas funções celulares em eventos fisiológicos e patológicos. ConBr é uma lectina isolada das sementes de Canavalia brasiliensis e possui alta afinidade por glicose/manose. Trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram que ConBr apresenta efeito neuroprotetor em relação às convulsões induzidas por ácido quinolínico e à excitotoxicidade glutamatérgica em fatias de hipocampo por mecanismos que podem envolver inibição de receptores NMDA e a modulção da via PI3K/Akt. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade no mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos que desencadeiam morte neuronal e de estratégias de neuroproteção. Culturas organotípicas hipocampais (COH) submetidas à privação de oxigênio e glicose representam um modelo in vitro de isquemia cerebral e têm sido utilizadas para compreender as alterações neuroquímicas e celulares nesse processo bem como para pesquisar possíveis agentes neuroprotetores. O objetivo desse estudo foi padronizar, para as condições locais, a técnica de cultura organotípica hipocampal (COH) e investigar o potencial neuroprotetor de ConBr sobre essas culturas submetidas à privação de oxigênio e glicose e reperfusão (POG/Rep). Nossos resultados demonstram que o tratamento com ConBr (1 µg/mL) diminuiu significativamente a morte celular induzida por POG na região CA1 do hipocampo. Através das análises de imunohistoquímica, podemos observar alterações na morfologia dos astrócitos com escassez de ramificações no grupo POG. O tratamento com ConBr promoveu significativa melhora da viabilidade celular sendo capaz de manter a densidade e morfologia dos astrócitos positivos para GFAP semelhantes ao grupo controle. Além disso, POG induziu uma diminuição de células positivas para NeuN e o tratamento com ConBr foi capaz de reverter esse processo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de neuroproteção de ConBr frente ao dano isquêmico, os resultados obtidos neste estudo indicam o potencial de lectinas de plantas como estratégia para neuroproteção.Abstract : Lectins are carbohydrate-binding proteins that can recognize glycoconjugates, regulating many cell functions in physiological and pathological events. ConBr is a lectin isolated from Canavalia brasiliensis seeds that displays high affinity for mannose/glucose. Previous work by our group demonstrated that ConBr displays neuroprotective effect against seizures induced by quinolinic acid and glutamatergic excitotoxicity in hippocampal slices, through a mechanism involving NMDA inhibition and modulation of PI3K/Akt. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality in the world, which makes this pathology target of many studies to understand the mechanisms that trigger neuronal deathand to search strategies for neuroprotection. Organotypic hippocampal cultures (OHCs) subjected to oxygen and glucose deprivation has been applied as in vitro model to study the neurochemical and cellular alterations in the cerebral ischemia, as well as to search compounds with neuroprotective activity. The aim of this study was to adapt the technic of organotypic hippocampal cultures (OHC) for our local conditions and investigate the neuroprotective potential of ConBr on these cultures subjected to oxygen and glucose deprivation and reperfusion (OGD/Rep). Our results demonstrate that treatment with ConBr (1µg/mL) significantly decrease OGD-induced cell death in CA1 region of the hippocampus. Through immunohistochemical analysis, we can observe changes in the morphology of astrocytes with scarcie ramifications in the OGD group. Treatment with ConBr promoted significant improvement in cell viability being able to maintain the density and morphology of the GFAP-positive astrocytes similar to the control group. In addition, we observed a decrease of NeuN-positive cells in the OGD group and treatment with ConBr was able to improve neuronal survival. Although further studies will be necessary to evaluate the neuroprotective mechanisms induced by ConBr against ischemic damage, the results obtained in the present study suggest the potential of plant lectins as a strategy for neuroprotection

Modulação sináptica da subunidade GluA4 do receptor AMPA e da pentraxina regulada pela atividade neuronal (Narp) na depressão e na epilepsia

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2021.Narp (pentraxina regulada pela atividade neuronal) é uma proteína expressa no sistema nervoso central de mamíferos que atua na modulação da plasticidade sináptica através da modulação de receptores glutamatérgicos do tipo AMPA. Narp pode participar na modulação fisiológica da atividade de interneurônios Gabaérgicos e tem sido implicada na fisiopatologia de diversas neuropatologias, incluindo epilepsia e transtorno depressivo maior. Drogas que atuam no sistema monoaminérgico podem regular o sistema glutamatérgico e, por isso, a investigação de proteínas associadas a esse sistema, como a Narp e a subunidade GluA4 do receptor AMPA, pode revelar modulações pouco exploradas desencadeadas por antidepressivos convencionais ou pela epilepsia, por exemplo. Inicialmente, este estudo teve como objetivo caracterizar os mecanismos neuroquímicos relacionados a modulação de Narp e GluA4 subjacentes ao tratamento agudo com compostos com atividade antidepressiva, como cetamina e a lectina ConBr, bem como frente ao tratamento crônico com fluoxetina, avaliando esses alvos proteicos no córtex pré-frontal e no hipocampo de camundongos. A administração aguda de cetamina 1 mg/kg (i.p.) e ConBr 10 µg/sítio (i.c.v.) bem como a administração crônica (21 dias) de fluoxetina 1 e 10 mg/kg (p.o.) foram eficazes na ação antidepressiva, pois reduziram o tempo de imobilidade no TNF, sem alterar a atividade locomotora no TCA. Não foram observadas alterações na modulação das proteínas analisadas por Western blot 8h, 18h e 24h após o tratamento agudo com cetamina e ConBr. Em contraste, foi observado que o tratamento crônico com fluoxetina 10 mg/kg promoveu aumento da fosforilação de CREB e expressão de BDNF no córtex pré-frontal e hipocampo. Além disso, no hipocampo, a fluoxetina induziu ativação de AKT e aumentou a expressão de Narp. No córtex pré-frontal, uma diminuição significativa na expressão da subunidade GluA4 e Narp foi observada após o tratamento crônico de fluoxetina (10 mg/kg). Esses resultados fornecem evidências de novos alvos moleculares potencialmente envolvidos nos efeitos antidepressivos da fluoxetina, uma vez que em roedores adultos Narp e GluA4 são expressos principalmente nas conexões sinápticas com interneurônios GABAérgicos positivos para parvalbumina (PV+). Outro objetivo desse trabalho foi determinar a distribuição das proteínas Narp, GluA4 juntamente com CREB, BDNF, TrkB e calcineurina no córtex (CTX), amígdala (AMG) e hipocampo (HIP) de humanos, bem como verificar a modulação dessas proteínas por dexametasona. As amostras foram obtidas de pacientes humanos acometidos de epilepsia do lobo temporal mesial com esclerose hipocampal (ELTM-EH) submetidos ao tratamento cirúrgico. Os resultados indicaram que o conteúdo relativo da proteína Narp é maior no HIP do que no CTX e AMG. Com relação à subunidade GluA4, seu conteúdo e nível de fosforilação total são maiores no CTX do que na AMG e HIP. Entretanto, a taxa de fosforilação de GluA4 é maior no CTX e AMG do que no HIP. Também foram investigadas outras proteínas-chave na neuroplasticidade como CREB, BDNF, TrkB e calcineurina. Apesar de não terem sido encontradas diferenças no conteúdo total, taxa de fosforilação e nível de fosforilação da proteína CREB, o conteúdo relativo de BDNF é maior na AMG em relação ao HIP. Quanto ao TrkB, o conteúdo total e o nível de fosforilação são bem maiores no CTX do que na AMG e HIP, enquanto a taxa de fosforilação de TrkB encontra-se aumentada na AMG, em comparação com as outras estruturas. Por fim, o conteúdo relativo de calcineurina é maior no CTX desses pacientes. Quando analisamos os efeitos da dexametasona, observamos aumento na taxa de fosforilação de GluA4 e na expressão de Narp no HIP de pacientes com ELTM-EH que receberam DEXA. Além disso, também foi observado no HIP de pacientes que receberam dexametasona aumento no imunoconteúdo de CREB acompanhado de uma diminuição na taxa de fosforilação dessa proteína. No CTX e AMG não foram encontradas alterações. Em conjunto, todas as modulações neuroquímicas determinadas nessas regiões cerebrais específicas e os efeitos de DEXA sobre os alvos estudados levantam a possibilidade de que Narp e GluA4 poderiam participar na fisiopatologia da epilepsia e especialmente podem ser alvos envolvidos na resposta à corticosteroides e eventualmente ao estresse, sugerindo a necessidade de estudos adicionais com essa abordagem. Em conjunto este trabalho contribui para o entendimento dos elementos moleculares envolvidos na ação antidepressiva da fluoxetina em um modelo animal, bem como traz uma descrição inicial do perfil de alguns parâmetros neuroquímicos em diferentes estruturas cerebrais de pacientes com ELTM-EH. Além disso, indica uma possível modulação de Narp e GluA4 em resposta aos corticosteroides em humanos.Abstract: Narp (neuronal activity-regulated pentraxin) is a protein expressed in the central nervous system of mammals that acts to modulate synaptic plasticity through the modulation of AMPA-type glutamatergic receptors. Narp may participate in the physiological modulation of GABAergic interneurons activity and has been implicated in the pathophysiology of several neuropathologies, including epilepsy and major depressive disorder. Drugs acting on the monoaminergic system can regulate the glutamatergic system and, therefore, the investigation of proteins associated with this system, such as Narp and the GluA4 subunit of the AMPA receptor, may reveal poorly explored modulations triggered by conventional antidepressants or by epilepsy, for example. Our study aimed to characterize the neurochemical mechanisms related to Narp and GluA4 modulation underlying acute treatment with compounds with antidepressant activity, such as ketamine and ConBr, as well as against chronic treatment with fluoxetine, evaluating these protein targets in the pre- frontal and hippocampus of mice. The acute administration of ketamine 1 mg/kg (ip) and ConBr 10 µg/site (icv) as well as the chronic administration (21 days) of fluoxetine 1 and 10 mg/kg (po) were effective in the antidepressant action, as they reduced the immobility time in TNF, without altering locomotor activity in OF. No alterations were observed in the modulation of proteins analyzed by Western blot 8h, 18h and 24h after acute treatment with ketamine and ConBr. In contrast, it was observed that chronic treatment with 10 mg/kg fluoxetine promoted increased CREB phosphorylation and BDNF expression in the prefrontal cortex and hippocampus. Furthermore, in the hippocampus, fluoxetine induced AKT activation and increased Narp expression. In the prefrontal cortex, a significant decrease in the expression of the GluA4 and Narp subunit was observed after chronic treatment with fluoxetine (10 mg/kg). These results provide evidence of new molecular targets potentially involved in the antidepressant effects of fluoxetine, since in adult rodents Narp and GluA4 are mainly expressed in synaptic connections with GABAergic interneurons positive for parvalbumin (PV+). Another objective of this work was to determine the distribution of proteins Narp, GluA4 together with CREB, BDNF, TrkB and calcineurin in the cortex (CTX), amygdala (AMG) and hippocampus (HIP) of humans, as well as to verify the modulation of these proteins by dexamethasone. Samples were obtained from human patients with mesial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis (ELTM-EH) undergoing surgical treatment. The results indicated that the relative content of Narp protein is higher in HIP than in CTX and AMG. Regarding the GluA4 subunit, its content and level of total phosphorylation are higher in CTX than in AMG and HIP. However, the phosphorylation rate of GluA4 is greater in CTX and AMG than in HIP. Other key proteins involved in neuroplasticity such as CREB, BDNF, TrkB and calcineurin were also investigated. Although the total content, phosphorylation rate and total phosphorylation level of CREB were not different between HIP, CTX and AMG, the relative content of BDNF was higher in AMG compared to HIP. Concerning TrkB, the total content and level of phosphorylation was much higher in CTX than in AMG and HIP, while the phosphorylation rate of TrkB was higher in AMG, compared to the other structures. Finally, the relative content of calcineurin was higher in the CTX of these patients. When we analyzed the effects of dexamethasone, we observed an increase in the rate of phosphorylation of GluA4 and in the expression of Narp in the HIP of patients with ELTM-EH who received DEXA. Furthermore, an increase in the immunocontent of CREB accompanied by a decrease in the rate of phosphorylation of this protein was also observed in the HIP of patients who received dexamethasone. In CTX and AMG no changes were found. Together, all neurochemical parameters determined in these specific brain regions and the effects of DEXA raise the possibility that Narp and GluA4 could participate in the pathophysiology of epilepsy and especially might be targets involved in the response to corticosteroids and eventually to stress, suggesting that further studies will be necessary. Together, this work contributes to the understanding of the molecular elements involved in the antidepressant action of fluoxetine in an animal model, as well as bring an initial description of the profile for some neurochemical parameters in different brain structures from ELTM-EH patients. Moreover, it indicates a possible modulation of Narp and GluA4 in response to corticosteroids in humans

Avaliação preliminar da associação entre anfotericina e hesperina com oxidantes e células huvec

A anfotericina B (AmB) é fármaco “padrão ouro” para o tratamento de infecções fúngicas invasivas desde 1960, Entretanto, a anfotericina B apresenta elevada toxicidade, a qual manifesta-se mais frequentemente nos rins e no fígado, Sabe-se, desde 1985, que a auto-oxidação da AmB origina diferentes formas de espécies reativas oxidativas e estas, por serem tóxicas para a célula, seriam responsáveis, em parte, pela toxicidade, Diferentes estudos indicam que a hesperidina contribui por meio do decréscimo do estresse oxidativo, para a proteção renal e contra a injúria gerada pela isquemia, Tal fato e o envolvimento da AmB na geração de radicais livres tornam interessante a avaliação preliminar do efeito da hesperidina e AmB (isoladamente ou associadas) frente a espécies reativas do oxigênio e radicais livres, bem como o estudo das mesmas em modelos de citoxicidade, Frente ao ABTS•+, a AmB apresentou IC50 igual a 0,0124mg/mL, mas quando associada à hesperidina este valor caiu para 0,0003mg/mL, Frente ao HOCl, a Amb apresentou IC50 igual a 0,0056, mas quando associada à hesperidina este valor caiu para 0,0023mg/mL, No ensaio com DPPH• e radical ânion superóxido as amostras não foram efetivas, No ensaio com células endoteliais em cultivo (HUVEC), as associações reduziram a viabilidade celular, Estes resultados preliminares evidenciam a interação dos compostos com espécies reativas bem como indicam possibilidade de exacerbação do dano pela AmB na presença dos antioxidantes em um modelo in vitro

Structural analysis of Dioclea lasiocatpa lectin : a C6 cells apoptosis-inducing protein

Lectins are multidomain proteins that specifically recognize various carbohydrates. The structural characterization of these molecules is crucial in understanding their function and activity in systems and organisms. Most cancer cells exhibit changes in glycosylation patterns, and lectins may be able to recognize these changes. In this work, Dioclea lasiocarpa seed lectin (DLL) was structurally characterized. The lectin presented a high degree of similarity with other lectins isolated from legumes, presenting a jelly roll motif and a metal-binding site stabilizing the carbohydrate-recognition domain. DLL demonstrated differential interactions with carbohydrates, depending on type of glycosidic linkage present in ligands. As observed by the reduction of cell viability in C6 cells, DLL showed strong antiglioma activity by mechanisms involving activation of caspase 3