Cultura de embrião e indução de brotos in vitro para micropropagação do pinhão‑manso

O objetivo deste trabalho foi otimizar o cultivo e desenvolvimento de embriões, bem como avaliar a indução da micropropagação do pinhão‑manso (Jatropha curcas) in vitro. Na primeira etapa, foi avaliada a influência da sacarose (concentrações 0, 15, 30 e 60 g L-1) no desenvolvimento de embriões em meio basal MS. Das plântulas geradas no cultivo de embriões, foram excisadas microestacas e colocadas em meio MS suplementado com os reguladores vegetais 6‑benziladenina (BA), 6‑benzilaminopurina (BAP), cinetina (6‑furfuriladenina) (KIN) e ácido 4‑(3‑indolil) butírico (AIB), nas concentrações 0,5, 1,0, 2,0 e 3,0 mg L-1. Os resultados evidenciaram que a faixa de 15 a 30 g L-1 de suplementação exógena da sacarose promove o melhor alongamento da parte aérea das plantas; a rizogênese, contudo, é mais vigorosa na faixa de 30 a 60 g L-1, em que ocorre aumento significativo do número de raízes. Na fase de micropropagação, o BAP à concentração de 2,0 mg L-1 induz maior número de brotações, enquanto a KIN (1,0 e 2,0 mg L-1) promove maior número de folhas. Ocorre calogênese na base das brotações, mais significativa na suplementação com 2,0 mg L-1 de 6‑BAP. A melhor concentração de sacarose, quanto ao vigor vegetal e rapidez na obtenção de explantes, é de 30 g L-1. Na micropropagação, os melhores resultados da organogênese direta de brotações ocorrem à concentração de 2,0 mg L-1 de BAP.The objective of this work was to optimize the cultivation and embryo development, as well as to evaluate in vitro micropropagation induction of physic nut (Jatropha curcas). In the initial stage, the influence of sucrose (concentrations of 0, 15, 30 and 60 g L-1) on the development of embryos in basal MS medium was evaluated. From the seedlings generated in the embryo culture, microcuttings were excised and inoculated on MS medium supplemented with the plant regulators 6‑benzyladenine (BA), 6‑benzylaminopurine (BAP), kinetin (6‑furfuryladenine) (KIN) and 4‑(3‑indolyl) butyric acid (IBA), in the concentrations of 0.5, 1.0, 2.0 and 3.0 mg L-1. The results showed that the range of 15 to 30 g L-1 of exogenous supplementation with sucrose promotes the best shoot elongation of plants; however, rhizogenesis is more vigorous in the range from 30 to 60 g L-1, in which a significant increase of the number of roots occurs. In the micropropagation phase, BAP at 2.0 mg L-1 concentration induces a higher number of shoots, while KIN (1.0 and 2.0 mg L-1) promotes a higher number of leaves. Callogenesis occurs on the shoot base, being more significant when supplemented with 2.0 mg L-1 of 6‑BAP. The best sucrose concentration, for plant vigor and speed in obtaining explants, is 30 g L-1. In micropropagation, the best results for direct shoot organogenesis occur at 2.0 mg L-1 BAP concentration

Cultura de embrião e indução de brotos in vitro para micropropagação do pinhão-manso

O objetivo deste trabalho foi otimizar o cultivo e desenvolvimento de embriões, bem como avaliar a indução da micropropagação do pinhão-manso (Jatropha curcas) in vitro. Na primeira etapa, foi avaliada a influência da sacarose (concentrações 0, 15, 30 e 60 g L-1) no desenvolvimento de embriões em meio basal MS. Das plântulas geradas no cultivo de embriões, foram excisadas microestacas e colocadas em meio MS suplementado com os reguladores vegetais 6-benziladenina (BA), 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (6-furfuriladenina) (KIN) e ácido 4-(3-indolil) butírico (AIB), nas concentrações 0,5, 1,0, 2,0 e 3,0 mg L-1. Os resultados evidenciaram que a faixa de 15 a 30 g L-1 de suplementação exógena da sacarose promove o melhor alongamento da parte aérea das plantas; a rizogênese, contudo, é mais vigorosa na faixa de 30 a 60 g L-1, em que ocorre aumento significativo do número de raízes. Na fase de micropropagação, o BAP à concentração de 2,0 mg L-1 induz maior número de brotações, enquanto a KIN (1,0 e 2,0 mg L-1) promove maior número de folhas. Ocorre calogênese na base das brotações, mais significativa na suplementação com 2,0 mg L-1 de 6-BAP. A melhor concentração de sacarose, quanto ao vigor vegetal e rapidez na obtenção de explantes, é de 30 g L-1. Na micropropagação, os melhores resultados da organogênese direta de brotações ocorrem à concentração de 2,0 mg L-1 de BAP

Enzyme activity of metabolism of secondary compounds related to in vitro rooting of Eucalyptus grandis HILL ex MAIDEN

O trabalho realizado constitui uma estratégia em Biotecnologia de Plantas para a investigação dos esquemas bioquímicos controladores da diferenciação celular no processo de enraizamento. Através da técnica da cultura de tecidos \"in vitro\" foram micropropagados clones de Eucalyptus grandis HILL ex MAIDEN (GO 250, GO 682 e GO 669) selecionadas no CEBTEC/USP. Em uma pesquisa preliminar foram estabelecidas e multiplicadas gemas, seguida de testes da composição de meios de cultura para elongação e enraizamento. Foram estudadas diversas possibilidades de balanceamento das substâncias reguladoras de crescimento - ácido indolilbutírico (AIB)/ benzilaminopurina (BAP). Os clones apresentaram comportamentos anatômico-fisiológicos (massa fresca e seca; teor protéico; taxas de multiplicação das brotações epicórmicas, elongação e enraizamento) diferenciados entre si. As frequências de enraizamento mostraram-se superiores às já observadas por outros autores. Foram estabelecidas, ainda, algumas alterações na composição dos meios de cultura empregados. Através de experimentos cinéticos foram determinados os padrões de indução e/ou inibição das enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL) e glucose 6-fosfato-desidrogenase (G-6P-DH) importantes para a biossíntese de compostos flavonóides, considerados como os principais cofatores das auxinas endógenas no complexo iniciador do enraizamento. Verificou-se que embora o suprimento exógeno crescente de AIB tenha resultado em maiores taxas de enraizamento, as atividades da PAL e G-6P-DH não se mostraram significativamente alteradas. Contudo, foi observado também que as gemas que enraizaram apresentaram atividade da PAL significativamente superior, evidenciando maior fluxo do Metabolismo do Fenilpropano durante o enraizamento.This study constitutes a strategy in Plant Biotechnology with the purpose to investigate the regulating biochemical development of the cellular differentiation in the rooting process. Through plant tissue culture \"in vitro\" technique, clones of Eucalyptus grandis Hill ex Maiden (GO 250, GO 682 e GO 669) selected at CEBTEC/USP, were micropropagated. In a preliminary study shoots were multiplied, followed by tests of media culture composition for shoot elongation and root initiation. Several possibilities and rates of plant growth regulators, indolilbutyric acid (IBA)/benzylaminopurine (BAP) were studied. The clones showed different anatomic-physiological behaviours (fresh and oven-dry weight; proteic content; epicormic shoots multiplication rates, elongation and rooting). The frequences of rooting were higher than those described by other authors. Some modifications in the composition of used cuIture media were also defined. Through kinetic experiments, induction and inhibition patterns of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and glucose 6- phosphate-dehydrogenase (G-6P-DH) important to the biossyntesis of flavonoid compounds were determined. They were considered as the main cofactors of endogenous auxins in the root stimulating complex. Although, the increasing exogenous supply of AIB resulted in higher rooting rates, the activities of PAl and G-6P-DH enzyme did not present alterations. However, it was also observed that shoots wich rooted, in the treatments, showed higher PAL activity. resulting in higher flux of phenylpropanoid metabolism during the rooting

Enzyme activity of metabolism of secondary compounds related to in vitro rooting of Eucalyptus grandis HILL ex MAIDEN

O trabalho realizado constitui uma estratégia em Biotecnologia de Plantas para a investigação dos esquemas bioquímicos controladores da diferenciação celular no processo de enraizamento. Através da técnica da cultura de tecidos \"in vitro\" foram micropropagados clones de Eucalyptus grandis HILL ex MAIDEN (GO 250, GO 682 e GO 669) selecionadas no CEBTEC/USP. Em uma pesquisa preliminar foram estabelecidas e multiplicadas gemas, seguida de testes da composição de meios de cultura para elongação e enraizamento. Foram estudadas diversas possibilidades de balanceamento das substâncias reguladoras de crescimento - ácido indolilbutírico (AIB)/ benzilaminopurina (BAP). Os clones apresentaram comportamentos anatômico-fisiológicos (massa fresca e seca; teor protéico; taxas de multiplicação das brotações epicórmicas, elongação e enraizamento) diferenciados entre si. As frequências de enraizamento mostraram-se superiores às já observadas por outros autores. Foram estabelecidas, ainda, algumas alterações na composição dos meios de cultura empregados. Através de experimentos cinéticos foram determinados os padrões de indução e/ou inibição das enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL) e glucose 6-fosfato-desidrogenase (G-6P-DH) importantes para a biossíntese de compostos flavonóides, considerados como os principais cofatores das auxinas endógenas no complexo iniciador do enraizamento. Verificou-se que embora o suprimento exógeno crescente de AIB tenha resultado em maiores taxas de enraizamento, as atividades da PAL e G-6P-DH não se mostraram significativamente alteradas. Contudo, foi observado também que as gemas que enraizaram apresentaram atividade da PAL significativamente superior, evidenciando maior fluxo do Metabolismo do Fenilpropano durante o enraizamento.This study constitutes a strategy in Plant Biotechnology with the purpose to investigate the regulating biochemical development of the cellular differentiation in the rooting process. Through plant tissue culture \"in vitro\" technique, clones of Eucalyptus grandis Hill ex Maiden (GO 250, GO 682 e GO 669) selected at CEBTEC/USP, were micropropagated. In a preliminary study shoots were multiplied, followed by tests of media culture composition for shoot elongation and root initiation. Several possibilities and rates of plant growth regulators, indolilbutyric acid (IBA)/benzylaminopurine (BAP) were studied. The clones showed different anatomic-physiological behaviours (fresh and oven-dry weight; proteic content; epicormic shoots multiplication rates, elongation and rooting). The frequences of rooting were higher than those described by other authors. Some modifications in the composition of used cuIture media were also defined. Through kinetic experiments, induction and inhibition patterns of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and glucose 6- phosphate-dehydrogenase (G-6P-DH) important to the biossyntesis of flavonoid compounds were determined. They were considered as the main cofactors of endogenous auxins in the root stimulating complex. Although, the increasing exogenous supply of AIB resulted in higher rooting rates, the activities of PAl and G-6P-DH enzyme did not present alterations. However, it was also observed that shoots wich rooted, in the treatments, showed higher PAL activity. resulting in higher flux of phenylpropanoid metabolism during the rooting

Biochemical and physiological behaviour of sugarcane plants (Saccharum spp. var. NA56-79) regenerated in vitro and in presence of herbicides

Plantas de cana-de-açúcar (Saccharum spp var. NA56-79) tolerantes ao ametrin (4-etilamino-6- isopropilamino-2-metiltio-1,3,5,-triazina) e dalapon (ácido 2,2-dicloropropiônico) foram regeneradas através da cultura de tecidos, em presença de diferentes concentrações dos herbicidas (0, 20, 40, 80 e 160 ppm) nos meios de cultura indutores da parte aérea e raiz. O experimento foi conduzido na Seção de Bioquímica de Plantas do Centro de Energia Nuclear na Agricultura, por um período de 10 semanas; os frascos de cultura foram incubados a uma temperatura de 24°C e iluminação fluorescente-incandescente. A frequência de regeneração das plantas foi feita através de avaliações visuais semanalmente. A maior regeneração de plantas de cana-de-açúcar tolerantes foi observada no tratamento com o herbicida triazínico ametrin, mesmo na concentração de 40 ppm, onde foram obtidas plantas inteiras. O dalapon mostrou ser o mais fitotóxico inibindo, na concentração de 20 ppm, a regeneração da parte aérea. Foi realizado ainda, um estudo do comportamento anatômico-fisiológico de plantas de cana-de-açúcar da mesma variedade, regeneradas em cultura de tecidos e cultivadas em solução nutritiva completa de Hoagland e Arnon em diferentes combinações: tempo de exposição (0, 2, 8, 32, 128 e 512 horas) concentração de dalapon (0, 25, 50 e 75 ppm). As plantas regeneradas foram testadas em casa de vegetação, por um período de 6 semanas e avaliadas através de medidas semanais de crescimento; produção final de matéria fresca e seca e quantificação das proteínas e açucares solúveis totais e redutores. O dalapon apresentou progressiva inibição do crescimento das plantas em combinações crescentes superiores a 32 horas de exposição - 25 ppm do herbicida. Efeitos teratogênicos na formação das plantas foram também observados. Combinações superiores a 32 horas de exposição - 50 ppm de dalapon promoveram aumento na estimativa do teor de proteínas, pela elevação dos níveis de nitrogênio total na planta. A presença de dalapon na solução nutritiva não alterou ou provocou a diminuição do teor de açúcares solúveis totais e redutores das plantas testadas. Os resultados diferem parcialmente daqueles obtidos em outros estudos da ação fitotóxica dos mesmos herbicidas em cultura de células de cana-de-açúcar não diferenciadas ou naquelas plantas propagadas e cultivadas de maneira convencional. Isso evidencia a ocorrência de variação somaclonal nas plantas regeneradas na cultura de tecidos. A técnica de regeneração de plantas prestou-se, portanto, à indução de variabilidade genética, ou à manifestação de variabilidade genética natural já existente na população original.Tolerant sugarcane plants (Saccharum spp var. NASB-79) to ametryn (4-ethylamino-6-isopropylamino-2-methyltio-1.3,5,-triazine) and to dalapon (2,2-dichloropropionic acid) were regenerated through tissue culture, with different herbicidal concentrations (0, 20, 40, 80, 160 ppm) in induction culture medium of shoot and root. The research was led at the Plant Biochemistry Sector, Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA, USP, Piracicaba-SP) for a period of 10 weeks; the culture flasks were incubated at 24°C under fluorescent-incandescent light. The frequency of plant regeneration was evaluated through weekly scores. At 40 ppm ametryn a great number of plants was regenerated. On the other hand, dalapon at 20 ppm inhibited plant regeneration. Morphological - physiological observation were made in the callus-regenerated plants which were grown in Hoagland and Arnons complete mineral nutrient solution in different combinations: exposure time (0, 2, 8, 32, 128, 512 hours)-dalapon concentration (0, 25, 50, 75 ppm). The regenerated plants were maintained in the greenhouse, for a period of 6 weeks and their growth was measured weekly. Final production of fresh and dry matter was made as well as the quantification of proteins and total soluble and reducer sugars. Progressive inhibition of plant growth was observed as dalapon concentration increased in the nutrient solution mainly in combinations above 32 hours of exposure - 25ppm of herbicide. Teratogenic effects in the plant formation were also observed. Combinations above 32 hours of exposure - 50ppm of dalapon caused an increase in the estimative of protein content, by rising the total nitrogen levels in the plant. The presence of the herbicide in the nutrient solution did not change total soluble sugar and reducing sugar content of the plants. The results were different from those obtained in other studies of phytotoxic action, using the same herbicides in cultures of non-differentiated sugarcane cells or on those plants cultured in the conventional way. This demonstrates that possibly somaclonal variation has occurred. The in vitro plant regeneration technique has served, therefore, to induce genetic variability, or to show natural genetic variability already existing in the original population

Meios de cultura no desenvolvimento de ápices caulinares de mamoneira (Ricinus communis L.) in vitro

A pesquisa da composição do meio de cultura mais adequado à espécie vegetal e ao tipo de explante empregado é o fator de maior relevância da cultura de tecidos. O cultivo de ápice caulinar com recuperação da planta matriz é uma técnica de grande impacto para a propagação de plantas in vitro, regeneração de plantas livres de vírus, conservação de germoplasma e modificação genética. Objetivou-se, neste trabalho, avaliar composições do meio de cultivo para organogênese direta in vitro a partir de ápices caulinares pertencentes à população FCA-UNESP-PB de mamoneira (Ricinus communis L.), com vistas à propagação clonal de genótipos elite. Foram testadas quatro formulações: MS básico (T1), MS modificado 1 (T2), MS modificado 2 (T3) e WPM (T4), em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 20 repetições em cada tratamento, sendo a repetição 1 ápice caulinar/frasco. O T3 apresentou-se superior e diferiu significativamente dos outros tratamentos apresentando 35% dos ápices caulinares diferenciados e desenvolvidos; seguiu-se o T2 com 10% e os tratamentos T1 e T4 não apresentaram diferenciação de tecidos. Os resultados permitiram concluir que os balanceamentos de sais minerais nos meios de cultura avaliados, especialmente a relação NO3 / NH4 e ausência de FeSO4.7H2O, indicaram grande influência no desenvolvimento de ápices caulinares de mamoneira.The research of the culture medium composition suitable for plant species and the type of explant to be used is the most significant factor in plant tissue culture. The culture of stem tips with plant donor recovery is a technique of great impact for the in vitro plant production, regeneration of virus-free plants, germoplasm conservation and genetic modification. The objective of this study was to evaluate culture media composition in vitro on direct organogenesis of the FCA-UNESP-PB population of castor bean (Ricinus communis L.), from stem tips for clonal propagation of elite genotypes. Four formulations were tested: basic MS (T1), modified MS 1 (T2), modified MS 2 (T3) and WPM (T4) in a completely randomized experimental design with 20 replicates pertreatment with 1stem tip/flask. The treatment T3was superior, and differed significantly from the other treatments, with 35% of stem tips developed, followed by 10% in T2. T1 and T4 showed no plant tissue differentiation. The results allowed to conclude that the balance of mineral salts and culture media evaluated especially the rate NO3 / NH4 and the absence of FeSO4.7H2O showed nigh influence on the development of stem tips of castor bean

Efeito de ANA e TDZ na calogênese in vitro de curauá (Ananas erectifolius L.B.Smith).

O curauá (Ananas erectifolius L. B. Smith) é uma bromélia originária do Complexo Amazônico cujas fibras naturais (biomassa renovável e biodegradável) substituem as de origem sintética na indústria, especialmente a automobilística, onde são empregadas na composição de novos materiais (“composites”). A calogênese e a produção de células não diferenciadas representa importante contribuição para o melhoramento genético da espécie, pois através da organogênese indireta pode-se obter variantes somaclonais, com valores agronômicos agregados, ou mesmo, facilitar a obtenção de protoplastos para o emprego da tecnologia molecular do DNA-recombinante. A indução da calogênese está relacionada ao “pool” de hormônios vegetais endógenos, sendo também influenciada pela suplementação exógena de reguladores vegetais; dentre estes, destacam-se o Thidiazuron (TDZ), por ser a mais potente das difeniluréias avaliadas na cultura de tecidos, e o ácido naftalenoacético (ANA), auxina bastante empregada na obtenção de calos. Este trabalho teve como finalidade desenvolver protocolo laboratorial para a indução da calogênese, manutenção e cultivo in vitro de células não diferenciadas provenientes de plantas de curauá. Foram selecionadas matrizes do banco de germoplasma do Departamento de Recursos Naturais (FCA-UNESP) e delas coletados rebentos jovens, que passaram por tratamentos prévios de desinfestação com benomyl, etanol (70%), hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) e proteção antioxidante com ácido ascórbico. Em condições assépticas, procedeu-se desfolhamento segundo a filotaxia original e a extração de gemas epicórmicas apicais e axilares. Os meristemas assim obtidos foram inoculados e estabelecidos in vitro em meio nutritivo basal de Murashige & Skoog (1962), consistência sólida, por um período de 20 dias, no escuro e temperatura ambiente de 27 ±3 Cº. As gemas “habituadas” foram transferidas para meio MS sólido suplementado com diferentes concentrações de ANA e TDZ: T1- ausência de reguladores; T2 – 0,0 mg. L-1 de ANA e 0,25 mg. L-1 de TDZ; T3 - 0,0 mg. L-1 de ANA e 0,5 mg. L-1 de TDZ; T4 – 0,0 mg. L-1 de ANA e 1,0 mg. L-1 de TDZ; T5 – 1,0 mg. L-1 de ANA e 0,0 mg. L-1 de TDZ; T6 - 2,0 mg. L-1 de ANA e 0,0 mg. L-1 de TDZ; T7 - 3,0 mg. L-1 de ANA e 0,0 mg. L-1 de TDZ. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado e o número de repetições 10, sendo 1 gema por frasco. Os resultados fisiológicos de massa fresca, massa seca e teor protéico total foram comparados estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05%). A calogênese e cultivo dos aglomerados mostraram-se viáveis na ausência de regulador de crescimento e nos tratamentos com TDZ, onde a produção de calos foi proporcional à elevação da concentração. O mesmo não ocorreu na presença de ANA e os meristemas, em poucos dias, entraram em senescência e posterior necrose. Como conclusões para a espécie e condições empregadas: o TDZ aplicado de maneira isolada pode ser um poderoso indutor da calogênese, especialmente na concentração de 1,00 mg.L-1; é possível a calogênese espontânea in vitro, em meio nutritivo basal MS, sem a presença de regulador vegetal; o ANA reprime a resposta promotora da calogênese

Rizogênese <i>in</i> <i>vitro</i> de curauá (<i>Ananas</i> <i>erectifolius</i> L.B.Smith) sob influência dos fitorreguladores AIB e ANA

O objetivo principal do trabalho foi o estudo da influência dos reguladores vegetais ANA e AIB na indução da organogênese da raiz e o acompanhamento de seu desenvolvimento, até a fase de transferência para aclimataçã

Extração e Caracterização de Uma Enzima Proteolítica do Curauá (Ananas erectifolius)

Ananas erectifolius (curaua) is a fibrous vegetable that can be found in North and Central West regions of Brazil. It is a bromeliaceae family plant which physico-chemical features provides great potential in the automobilistic industry as a source of fibers. As commonly described in other bromeliaceae species, it contains significant levels of bromelain, of high commercial value and wide range of aplications in food, pharmaceutical and cosmetic industry. In this paper, experimental tests were performed to evaluate the extraction of the proteolytic enzymes of the Ananas erectifolius under different pH and temperature conditions to determine in which ones the enzymatic activity would be the maximum for later purification of the bromelain. The two commercially available curaua varieties (white and purple) were used in the experiments and the results showed the same optimal pH of 8,5 for both varieties and different temperatures of 30ºC for the white one, and 10ºC, 20ºC and 35ºC for the purple one.O curauá (Ananas erectifolius) é uma planta fibrosa encontrada no Norte e Centro-Oeste do Brasil, uma bromeliácea de características físico-químicas que lhe conferem grande potencial de utilização na indústria automobilística, como fonte de fibra. Como toda planta da família Bromelianceae contém níveis significativos de enzima bromelina, de alto valor comercial e com ampla aplicação também na indústria farmacêutica, alimentícia e cosmética. Neste trabalho, foram realizados testes experimentais de extração da enzima proteolítica do curauá sob diferentes condições de pH e temperatura, medindo-se a atividade enzimática para cada um dos ensaios, utilizando-se o relativo de Biureto e determinando-se a temperatura e pH ótimos de sua utilização, ou seja, valores em que a atividade enzimática da enzima é máxima, com o objetivo de otimizar as condições de uso do resíduo para posterior purificação. Foram utilizadas as duas variedades comercialmente encontradas. (branca e roxa.) Os resultados mostraram que o curauá possui enzimas com atividade proteólica, sendo o pH ótimo 8,5 para as duas variedades e temperaturas ótimas de 30°C para a espécie branca, e 10°C, 20°C e 35°C para a roxa