Fibrin and Marine-Derived Agaroses for the Generation of Human Bioartificial Tissues: An Ex Vivo and In Vivo Study

Development of an ideal biomaterial for clinical use is one of the main objectives of current research in tissue engineering. Marine-origin polysaccharides, in particular agaroses, have been widely explored as scaffolds for tissue engineering. We previously developed a biomaterial based on a combination of agarose with fibrin, that was successfully translated to clinical practice. However, in search of novel biomaterials with improved physical and biological properties, we have now generated new fibrin-agarose (FA) biomaterials using 5 different types of agaroses at 4 different concentrations. First, we evaluated the cytotoxic effects and the biomechanical properties of these biomaterials. Then, each bioartificial tissue was grafted in vivo and histological, histochemical and immunohistochemical analyses were performed after 30 days. Ex vivo evaluation showed high biocompatibility and differences in their biomechanical properties. In vivo, FA tissues were biocompatible at the systemic and local levels, and histological analyses showed that biointegration was associated to a pro-regenerative process with M2-type CD206-positive macrophages. These results confirm the biocompatibility of FA biomaterials and support their clinical use for the generation of human tissues by tissue engineering, with the possibility of selecting specific agarose types and concentrations for applications requiring precise biomechanical properties and in vivo reabsorption times.Hispanagar SA, Burgos, Spain, through CDTI, Ministry of Science and Innovation, Spain, Programa Operativo Plurirregional de Crecimiento Inteligente (CRIN) IDI-20180052Spanish Plan Nacional de Investigacion Cientifica, Desarrollo e Innovacion Tecnologica (I + D + I) of the Spanish Ministry of Science and Innovation (Instituto de Salud Carlos III) FIS PI20/0317 FIS PI20/0318 FIS PI21/0980 ICI19/00024 ICI21/00010Junta de Andalucia PE-0395-2019 PI-0442-2019 PI-0086-2020Consejeria de Transformacion Economica, Industria, Conocimiento y Universidades B-CTS-504-UGR2

Tratamiento de perforaciones de la membrana timpánica e incontinencia urinaria de esfuerzo mediante ingeniería tisular

271 p.La ingeniería tisular es un campo interdisciplinar que permite el desarrollo de sustitutos biológicos con fin terapéutico. Su firme objetivo es restaurar y regenerar los tejidos, redefiniendo la forma en la que se abordan las patologías. Para ello se basa en la combinación de las siguientes herramientas: 1) biomateriales, 2) células, 3)moléculas bioactivas y 4) tecnologías de fabricación. La efectividad de los tratamientos se basa en la capacidad para aplicar estas herramientas de manera estratégica y adaptativa a cada patología específica. La presente tesis doctoral explora estrategias que aplican este principio, centrándose en el desarrollo de tratamientos específicos basados en la ingeniería tisular para las perforaciones crónicas de la membrana timpánica y la incontinencia urinaria de esfuerzo.Por un lado, las perforaciones crónicas de la membrana timpánica son una afección frecuente, principalmente originada por traumatismos e infecciones del oído. Aunque en la mayoría de los casos las perforaciones tienden a cerrarse de manera espontánea gracias a la actividad de células madre latentes, la ubicación, tamaño y otros factores pueden dar lugar a la persistencia de la lesión. Actualmente, el enfoque terapéutico convencional implica intervenciones quirúrgicas de reconstrucción, las cuales son altamente invasivas, requieren habilidades quirúrgicas significativas y están asociadas a costos elevados; además, su efectividad no está garantizada en todos los casos. Por ende, en este estudio se ha explorado una alternativa terapéutica basada en el desarrollo de un sustituto biomimético conformado por una película acelular compuesta de materiales naturales. La precisa elección de sus componentes dotó al constructo de las características más apropiadas no solo para servir de soporte estructural, sino para apoyar el proceso regenerativo. En efecto, el sustituto exhibió potencial como tratamiento para las perforaciones crónicas en un modelo animal, logrando el cierre de las perforaciones en un plazo de 10 días de tratamiento y facilitando una restauración integral de la estructura histológica.Por otro lado, la incontinencia urinaria de esfuerzo es una afección con alta prevalencia basada en la disfunción del esfínter urinario debido a diversas razones, como el parto vaginal o el envejecimiento. Los tratamientos actuales van dirigidos contra los síntomas de la enfermedad y no restablecen la función esfinteriana de forma efectiva. Además,las complicaciones asociadas a algunos de los tratamientos están generando cada vez más preocupación en los pacientes y la convicción de que merecen mejores terapias. Esta patología es una diana ideal en terapia celular y medicina regenerativa; sin embargo, los ensayos clínicos de inyección de células han demostrado que las fuentes celulares no siempre son adecuadas para su finalidad. En este contexto, este trabajo tiene como objetivo generar un wrap celularizado como tratamiento para la incontinencia urinaria de esfuerzo. Para ello, basándose en la combinación de células precursoras que favorecen los procesos de regeneración, neuroregeneración yrevascularización del músculo estriado, se han desarrollado biotintas derivadas de tejidos descelularizados y se han optimizado técnicas de fabricación centradas en la bioimpresión 3D. En primer lugar, en la búsqueda de las fuentes celulares, se demostró que el cultivo en suspensión de las células aisladas de músculos de ratón deriva en laformación de esferas con una composición celular heterogénea. Concretamente, se describió la presencia de una población CD56+, que se compone de subpoblaciones con diferentes niveles de potencialidad que permiten, de manera paralela, la diferenciación miogénica y la conservación de la plasticidad celular, lo que podría ser de granutilidad para su aplicación clínica. En segundo lugar, la descelularización de los tejidos resultó en la obtención de biotintas que conservan parcialmente la complejidad composicional de los tejidos nativos. De esta manera se ha demostrado que, en el caso de la biotinta muscular, la composición específica de las tintas derivadas de los tejidos descelularizados proporcionan no solo soporte estructural para las células sino las señales correspondientes paramodular el comportamiento celular, permitiendo tanto la conservación del potencial celular como la diferenciación miogénica

Evaluation of Marine Agarose Biomaterials for Tissue Engineering Applications

Five agarose types (D1LE, D2LE, LM, MS8 and D5) were evaluated in tissue engineering and compared for the first time using an array of analysis methods. Acellular and cellular constructs were generated from 0.3–3%, and their biomechanical properties, in vivo biocompatibility (as determined by LIVE/DEAD, WST-1 and DNA release, with n = 6 per sample) and in vivo biocompatibility (by hematological and biochemical analyses and histology, with n = 4 animals per agarose type) were analyzed. Results revealed that the biomechanical properties of each hydrogel were related to the agarose concentration (p < 0.001). Regarding the agarose type, the highest (p < 0.001) Young modulus, stress at fracture and break load were D1LE, D2LE and D5, whereas the strain at fracture was higher in D5 and MS8 at 3% (p < 0.05). All agaroses showed high biocompatibility on human skin cells, especially in indirect contact, with a correlation with agarose concentration (p = 0.0074 for LIVE/DEAD and p = 0.0014 for WST-1) and type, although cell function tended to decrease in direct contact with highly concentrated agaroses. All agaroses were safe in vivo, with no systemic effects as determined by hematological and biochemical analysis and histology of major organs. Locally, implants were partially encapsulated and a pro-regenerative response with abundant M2- type macrophages was found. In summary, we may state that all these agarose types can be safely used in tissue engineering and that the biomechanical properties and biocompatibility were strongly associated to the agarose concentration in the hydrogel and partially associated to the agarose type. These results open the door to the generation of specific agarose-based hydrogels for definite clinical applications such as the human skin, cornea or oral mucosa.Hispanagar SA, Burgos, Spain, through CDTI, Ministry of Science and Innovation, Spain, Programa Operativo Plurirregional de Crecimiento Inteligente (CRIN) IDI-20180052ISCIII thorough AES AC17/00013Junta de Andalucía PE-0395-2019Spanish Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (I+D+i) from Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Instituto de Salud Carlos III) FIS PI17/0391Fondo Europeo de Desarrollo Regional ERDF-FEDER, European Union PI20/031

Evaluation of Marine Agarose Biomaterials for Tissue Engineering Applications

Five agarose types (D1LE, D2LE, LM, MS8 and D5) were evaluated in tissue engineering and compared for the first time using an array of analysis methods. Acellular and cellular constructs were generated from 0.3-3%, and their biomechanical properties, in vivo biocompatibility (as determined by LIVE/DEAD, WST-1 and DNA release, with n = 6 per sample) and in vivo biocompatibility (by hematological and biochemical analyses and histology, with n = 4 animals per agarose type) were analyzed. Results revealed that the biomechanical properties of each hydrogel were related to the agarose concentration (p < 0.001). Regarding the agarose type, the highest (p < 0.001) Young modulus, stress at fracture and break load were D1LE, D2LE and D5, whereas the strain at fracture was higher in D5 and MS8 at 3% (p < 0.05). All agaroses showed high biocompatibility on human skin cells, especially in indirect contact, with a correlation with agarose concentration (p = 0.0074 for LIVE/DEAD and p = 0.0014 for WST-1) and type, although cell function tended to decrease in direct contact with highly concentrated agaroses. All agaroses were safe in vivo, with no systemic effects as determined by hematological and biochemical analysis and histology of major organs. Locally, implants were partially encapsulated and a pro-regenerative response with abundant M2-type macrophages was found. In summary, we may state that all these agarose types can be safely used in tissue engineering and that the biomechanical properties and biocompatibility were strongly associated to the agarose concentration in the hydrogel and partially associated to the agarose type. These results open the door to the generation of specific agarose-based hydrogels for definite clinical applications such as the human skin, cornea or oral mucosa.This research was funded by grant IDI-20180052 (Agarmatriz), leaded by Hispanagar SA, Burgos, Spain, through CDTI, Ministry of Science and Innovation, Spain, Programa Operativo Plurirregional de Crecimiento Inteligente (CRIN); award no. AC17/00013 (NanoGSkin project) by ISCIII thorough AES 2017 within the EuroNanoMed framework; grant PE-0395-2019 from Consejería de Salud y Familias, Junta de Andalucía, Spain; and by the Spanish Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (I+D+i) from Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Instituto de Salud Carlos III), grants FIS PI17/0391, and PI20/0317 (co-financed by Fondo Europeo de Desarrollo Regional ERDF-FEDER, European Union).Ye