Transferrin-Conjugated SNALPs Encapsulating 2 -O-Methylated miR-34a for the Treatment of Multiple Myeloma

Stable nucleic acid lipid vesicles (SNALPs) encapsulating miR-34a to treat multiple myeloma (MM) were developed. Wild type or completely 2 -O-methylated (OMet) MiR-34a was used in this study. Moreover, SNALPs were conjugated with transferrin (Tf) in order to target MM cells overexpressing transferrin receptors (TfRs). The type of miR-34a chemical backbone did not significantly affect the characteristics of SNALPs in terms of mean size, polydispersity index, and zeta potential, while the encapsulation of an OMet miR-34a resulted in a significant increase of miRNA encapsulation into the SNALPs. On the other hand, the chemical conjugation of SNALPs with Tf resulted in a significant decrease of the zeta potential, while size characteristics and miR-34a encapsulation into SNALPs were not significantly affected. In an experimental model of MM, all the animals treated with SNALPs encapsulating miR-34a showed a significant inhibition of the tumor growth. However, the use of SNALPs conjugated with Tf and encapsulating OMet miR-34a resulted in the highest increase of mice survival. These results may represent the proof of concept for the use of SNALPs encapsulating miR-34a for the treatment of MM

NANOVETTORI A BASE LIPIDICA PER LA VEICOLAZIONE DI FARMACI

Con il termine di nanotecnologie si indicano quell’insieme di conoscenze necessarie per la progettazione, caratterizzazione, produzione ed applicazione di strutture, dispositivi e sistemi di dimensioni nanometriche. In campo biomedico l’impiego di nanotecnologie offre notevoli vantaggi, quali la possibilità di direzionare il farmaco in un determinato distretto cellulare o in un organo specifico, favorire il passaggio di farmaci attraverso le barriere biologiche, consentire la somministrazione di farmaci poco solubili o instabili nei fluidi biologici (es. molecole di natura biotecnologia). Tra i diversi nonosistemi sviluppati a scopo terapeutico, quelli basati su materiali lipidici hanno riscosso fino ad ora i maggiori successi, con diversi prodotti attualmente in commercio e numerosi in sperimentazione clinica. Il successo di tali vettori è dovuto sicuramente alla biocompatibilità e biodegradabilità della maggior parte dei materiali utilizzati, alla facilità di preparazione, ai costi contenuti e soprattutto alla versatilità d’impiego che ne consente l’utilizzo per svariati scopi e per diverse classi di farmaci. I capostipiti di nanovettori di natura lipidica sono sicuramente i liposomi, vescicole in cui una o più membrane lipidiche racchiudono una soluzione acquosa. Nel corso degli anni, i liposomi hanno subito una continua evoluzione mirata a soddisfare diverse esigenze terapeutiche e diagnostiche. Sono così stati sviluppati liposomi a lunga circolazione, destinati alla somministrazione per via endovenosa, che hanno dimostrato grandi potenzialità nella terapia antitumorale, con possibilità di funzionalizzare il carrier per un rilascio sempre più sito specifico; altre vie di somministrazione, quale quella topica, hanno visto lo sviluppo di nuovi carrier definiti liposomi ultraflessibili (o transferosomi) ed etosomi. L’attività di ricerca nell’ambito del Corso di Dottorato è stata incentrata sullo sviluppo di nuovi nanosistemi lipidici per la veicolazione di farmaci. La ricerca è stata articolata su due direttrici principali, nelle quali sono state affrontate le diverse problematiche connesse alla progettazione ed allo sviluppo di nanosistemi per la veicolazione di farmaci destinati alla somministrazione per via sistemica e per via topica

Transferosomes and ethosomes for the trans-resveratrol permeation through the skin: a comparative study.

Introduction: The trans-resveratrol (t-res) is a non flavonoid polyphenol with promising properties for the treatment or prevention of different diseases. In particular, topical application of resveratrol could be advantageous in the prevention of skin cancer or in the treatment of inflammation-based diseases such as psoriasis. However, different studies demonstrated the importance of the formulation to enhance t-res delivery into or trough the skin. Nanocarriers, such as ethosomes and transferosomes, have been successfully used to deliver drugs with different characteristics into or through the skin. Purpose: The aim of the present work was to develop a nanocarrier-based formulations for skin delivery of t-res. Methods: Ethosomes or transferosomes containing t-res were prepared by a modified hand-shaking method followed by extrusion or sonication. All the formulations were characterised in terms of mean diameter, size distribution (I.P.), t-res loading, t-res stability upon encapsulation during storage at 4°C. The inhibition of reactive oxygen species (ROS) and lipids peroxidation in human keratinocyte (HaCaT) cell line stimulated with H2O2 for 24 h and then incubated with the t-res containing nanocarriers was investigated. Moreover, for all the formulations, ex vivo permeation studies on porcine skin was carried out by means of Franz diffusion cells. At appropriate intervals (0.5, 1, 2, 4, 6, 24 h), an aliquots of the receptor medium were withdrawn and the t-res concentration was determined by HPLC. Results: All the t-res containing carriers were characterised by a very high (between 70 to 100%) encapsulation efficiency, a limited t-res release at 4°C during the storage and stability of resveratrol in its trans form. Nanocarriers encapsulating t-res reduced, in a concentration-dependent manner, ROS production induced by H2O2, with the higher effect observed in the case of ethosomes. Permeation studies showed that only ethosomes were able to promote t-res permeation through porcine skin and this effect was affected by lipid composition of the carrier. Conclusions: In this work, transferosomes showed the highest encapsulation efficiency and the lowest t-res release. On the other hand, only ethosomes were able to promote t-res permeation through the skin

Etosomi e transferosomi per la veicolazione topica del resveratrolo

Introduzione: Il trans-resveratrolo è un polifenolo non flavonoide di origine naturale particolarmente abbondante nella buccia degli acini d’uva. Esistono due isoforme del resveratrolo, il trans ed cis il resveratrolo (quest’ultimo meno attivo). Numerosi sono gli effetti farmacologici attribuiti al resveratrolo, quali antitumorale, antiinfiammatorio, antivirale ed antibatterico soprattutto a livello cutaneo. Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha evidenziato l’utilità del trans-resveratrolo nel trattamento dell’acne volgare. Scopo del lavoro: Lo sviluppo di nanovettori a base lipidica, etosomi e transferosomi (nanovettori che hanno mostrato migliorare la penetrazione e/o la permeazione di farmaci nella cute3), per la veicolazione topica del resveratrolo, per accumulare tale molecola nella cute, garantendone però la sua stabilità. Materiali e metodi: I vettori sono stati preparati mediante la tecnica del film lipidico, successivo dimensionamento tramite estrusione o sonicazione. I transferosomi sono stati preparati con tre diversi attivatori di membrana, ed in particolare con Tween 80, sodio colato e sodio deossicolato. I vettori sono poi stati caratterizzati in base a dimensioni, indice di polidispersità, tassi d’incapsulazione, rilascio del resveratrolo. Le analisi sono state effettuate dopo preparazione e dopo conservazione a 4°C. Inoltre sono stati effettuati saggi in vitro per valutare la tossicità dei carrier e la capacità di tali vettori di ridurre la produzione di radicali dell’ossigeno in cheratinociti umani stimolati con H2O2. Risultati e conclusioni: Sono state ottenute formulazioni con diametro medio introno ai 100 nm, con un indice di polidispersità (IP) molto basso (< 0,1), ad eccezione dei transferosomi contenenti Tween80 (IP di 0,3-0,4). Dopo 30 giorni di conservazione non sono state osservate variazioni nel diametro medio. Tutte le formulazioni sono caratterizzare da un alto tasso d’incapsulazione, che non varia in maniera significativa dopo conservazione a 4°C. In studi su colture cellulari, è stata osservata riduzione della vitalità solo con la formulazione contenente il Tween80, tossicità che però viene quasi del tutto annullata in presenza di resveratrolo incapsulato. In saggi sull’attività antiossidante, è stato osservato che il solo resveratrolo è in grado di ridurne in maniera significativa la produzione di radicali dell’ossigeno (ROS) in maniera concentrazione-dipendente. Tutte le formulazioni (ad eccezione di quella contente Tween80), riducono la produzione di ROS in maniera simile al solo resveratrolo

Liposomi stealth per la veicolazione di trans-resveratrolo in tumori solidi.

Introduzione. Il trans-resveratrolo è un polifenolo non flavonoide di origine naturale particolarmente abbondante nella buccia degli acini d???uva. Numerosi studi sono stati focalizzati sulla capacità del trans-resveratrolo di bloccare l???insorgenza di neoplasie e la loro diffusione (Gupta et al. 2010, Gupta et al. 2011). Numerosi studi hanno infatti dimostrato un???attività citotossica dose dipendente di queste molecole in diverse linee cellulari (Kang et al 2011, Jung et al. 2011, Lee et al. 2011). L???impiego del resveratrolo in terapia è però ostacolato da problemi biofarmaceutici. In particolare esso è caratterizzato da una bassa biodisponibilità e da una breve emivita anche in seguito alla rapida metabolizzazione da parte di fegato e reni (Baur e Sinclair, 2006). Inoltre, il trans-resveratrolo subisce una rapida trasformazione nel suo isomero cis meno attivo, se esposto alla luce. Un approccio molto studiato per migliorare il profilo farmacocinetico di farmaci antitumorali prevede l???impiego di nanovettori, in particolare a base lipidica. L???interesse nei confronti di tali sistemi deriva da diversi vantaggi, quali la loro capacità di proteggere il farmaco incapsulato dalla degradazione nei fluidi biologici, di promuoverne l???assorbimento attraverso gli epiteli e infine, migliorarne la distribuzione e la penetrazione intracellulare (Langer et al., 2009). Tra questi i liposomi sono sicuramente tra più utilizzati e presenti oggigiorno in commercio (Doxil, DaunoXone). Scopo del lavoro. Questo lavoro è stato incentrato sullo sviluppo di nanovettori lipidici per una terapia antitumorale a base di trans-resveratrolo. Metodi. Sono stati sviluppati liposomi stealth contenenti concentrazioni crescenti (0,1; 1 e 5 mg/ml) di trans-resveratrolo. Le formulazioni sono state caratterizzate in termini di diametro medio ed indice di polidispersità, nonché efficienza d???incapsulazione e rilascio di trans-resveratrolo durante la conservazione a 4°C. E??? stata inoltre valutata la possibilità di liofilizzare le preparazioni, con e senza un crioprotettore, usato a diverse concentrazioni. La formulazione con le migliori caratteristiche è stata poi saggiata in vitro su cellule di carcinoma pancreatico umane per valutare l???attività antiproliferativa del trans-resveratrolo, in forma libera o incapsulato in liposomi. Risultati. Sono stati ottenuti liposomi con diametro medio compreso tra 110 e 130 nm e con buona distribuzione dimensionale, con indice di polidispersità inferiore a 0,2. La quantità di trans-resveratrolo incapsulato nelle diverse formulazioni non risulta influenzare le caratteristiche dimensionali dei vettori, mentre condiziona significativamente l???efficienza d???incapsulazione. In particolare, utilizzando la concentrazione più alta (5 mg/ml) consente l???incapsulazione di quantità maggiori di trans- resveratolo. Dopo conservazione a 4°C, tuttavia, si è osservato un significativo rilascio di trans-resveratrolo dalle formulazioni, dal 70 all???83% rispetto alla quantità totale incapsulata. Le formulazioni sono state quindi liofilizzate in assenza o in presenza di lattosio e trealosio, utilizzati come crioprotettori, impiegati alle concentrazioni 1:5 e 1:10 (p/p) rispetto al contenuto di lipidi di ciascuna preparazione. I liposomi, in seguito a liofilizzazione risultano aggregati/fusi, come risulta dall???aumento delle dimensioni medie e dell???indice di polidispersità. Entrambi i crioprotettori, solo però se utilizzati alla concentrazione di 1:10 (p/p), si sono dimostrati efficaci nell garantire la stabilità dei liposomi, is seguito a liofilizzazione e successiva ridispersione in mezzo acquoso. La formulazione con più elevato grado di incapsulazione di trans-resveratrolo è stata quindi saggiata su colture cellulari. In tali studi è stato dimostrato che il solo trans-resveratolo possiede un???attività antiproliferativa concentrazione dipendente. L???incubazione delle cellule con liposomi contenenti il trans-resveratrolo ha portato ad un significativo potenziamento dell???effetto antiproliferativo. Conclusioni. In questo studio sono stati sviluppati liposomi stealth per la veicolazione di liposomi in tumori solidi. La scarsa stabilità fisica delle formulazioni hanno reso necessario la liofilizzazione dei liposomi con impiego di crioprotettori. In forma incapsulata, il trans-resveratrolo ha mostrato un maggiore effetto antiproliferativo, se confrontato con il trans-resveratrolo in forma libera, su diverse linee cellulari. Studi futuri saranno effettuati su diversi modelli animali di cancro

Effetti delle piastrine e dei leucociti sulla proliferazione delle cellule muscolari in vitro: ruolo dei mediatori chimici di derivazione piastrinica.

Some evidence indicate that platelets (PLTs) and leukocytes might contribute to the development of neointimal hyperplasia following arterial injury, via release of several growth factors. To study the relative contribution of these cells and of growth factors released in consequence of activation, smooth muscle cells (SMCs), isolated from the aorta of New Zealand White rabbits, were grown in Dulbecco's medium containing 10% fetal calf serum (FCS). At 70% confluence, SMCs were made quiescent by removing FCS from the medium. Twenty-four hours later, the cells were stimulated with activated platelets, neutrophils, lymphocytes+monocytes, whole leukocytes and platelets + whole leukocytes. Then, 1 microCi of O3H-thymidine were added to SMC cultures to evaluate the degree of proliferation. Relative contribution of different PLT-derived mediators to SMC growth was evaluated by adding either ketanserin, a 5-HT2 receptor antagonist, ridogrel, a thromboxane A2 (TxA2) receptor antagonist, BN52021, a platelet activating factor (PAF) receptor antagonist, and trapidil, a platelet-derived growth factor (PDGF) receptor antagonist, or all antagonists together. SMC proliferation was significantly increased by platelet activation. This effect was reduced by adding either ketanserin, ridogrel, BN 52021 or trapidil. Neutrophils, lymphocytes + monocytes and whole leukocytes also increased SMC proliferation. Simultaneous stimulation of SMCs by platelets and whole leukocytes was associated with a significant increase in SMC proliferation as compared to platelets or leukocytes alone. Thus, TxA2, 5-HT, PAF, and PDGF all contribute to SMC proliferation in vitro. Adding all antagonist together resulted in an additive antiproliferative effect. Leukocytes are also important in SMC proliferation. Interaction between platelets and leukocytes may play a pivotal role in the modulation of this phenomenon