CMV infection of liver transplant recipients: comparison of antigenemia and molecular biology assays

BACKGROUND: CMV is a major clinical problem in transplant recipients. Thus, it is important to use sensitive and specific diagnostic techniques to rapidly and accurately detect CMV infection and identify patients at risk of developing CMV disease. In the present study, CMV infection after liver transplantation was monitored retrospectively by two molecular biology assays - a quantitative PCR assay and a qualitative NASBA assay. The results were compared with those obtained by prospective pp65 antigenemia determinations. MATERIALS AND METHODS: 87 consecutive samples from 10 liver transplanted patients were tested for CMV by pp65 antigenemia, and CMV monitor and NASBA pp67 mRNA assay. RESULTS: CMV infection was detected in all patients by antigenemia and CMV monitor, whereas NASBA assay identified only 8/10 patients with viremia. Furthermore, CMV infection was never detected earlier by molecular biology assays than by antigenemia. Only 5/10 patients with CMV infection developed CMV disease. Using a cut off value of 8 cells/50,000, antigenemia was found to be the assay that better identified patients at risk of developing CMV disease. However, the kinetics of the onset of infection detected by NASBA and CMV monitor seemed to have better identified patients at risk of developing CMV disease. Furthermore, before onset of disease, CMV pp67 mRNA was found to have similar or better negative and positive predictive values for the development of CMV disease. CONCLUSIONS: The present data, suggests that the concomitant use of antigenemia and pp67 mRNA assay gives the best identification of patients at risk of developing CMV disease

Quantification du cytomégalovirus par la technique de PCR en temps réel

Ce travail a consisté à développer une technique de PCR en temps réel pour la quantification du CMV dans la fraction leucocytaire du sang. Une co-amplification du génome viral et du gène de l'albumine a été effectuée, dans un même tube, pour obtenir un résultat précis sur lequel les rendements des étapes de préparation de l'ADN et d'amplification n'interfèrent pas. Tout d'abord, nous avons optimisé les paramètres opératoires pour obtenir les meilleures conditions de réalisation de la technique et testé sa spécificité. Puis par clonage plasmidique, nous avons réalisé une gamme standard avec laquelle ont été évalués la sensibilité, la linéarité et la reproductibilité de la méthode. L'application de la PCR à de véritables prélèvements biologiques a permis d'apporter des modifications pour augmenter la sensibilité de cette méthode.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocSudocFranceF

Le cytomégalovirus humain (moyens d'étude de la multiplication)

Le cytomégalovirus humain (CMVH), membre de la famille des Herpesviridae, est un virus ubiquitaire dont le pouvoir pathogène lors de l'infection active est étroitement associé à la qualité de la réponse immunitaire. La grande taille de son génome lui permet de coder pour de nombreuses protéines qui peuvent moduler la réponse immune. Les génomes des souches cliniques de CMVH présentent une homologie de séquence de l'ordre de 90, mais il existe des zones de polymorphisme au sein de régions du génome codant notamment pour des protéines impliquées dans le tropisme cellulaire des différentes souches de CMVH ou dans les mécanismes d'échappement à la réponse immunitaire. Nous avons étudié le polymorphisme des gènes IE1, UL55 et UL22A dans une cohorte de patients. L'étude phylogénique de la séquence complète du gène UL22A, qui code une protéine glycosylée et sécrétée capable de se lier spécifiquement à la chimiokine CCL5, a permis de différencier trois groupes génomiques dont la répartition n'est pas identique entre les différentes populations de patients (VIH, allogreffés ou immunocompétents). Des outils de mesure de la réplication (PCR duplex CMV/albumine) et de la transcription virale (RT PCR ffil, MCP et UL22A) basés sur des méthodes d'amplification génique par technologie temps réel ont été développés pour suivre la multiplication virale in vitro et in vivo afin de comparer le comportement des différentes souches virales entre elles. Une technique de détection d'un antigène viral très précoce par cytométrie en flux a également été développée. Ces méthodes ont été appliquées au suivi de la réplication de deux souches de CMVH dénommées TB40/E et VHL/E, caractérisées par un tropisme endothélial conservé, sur des fibroblastes et des cellules dendritiques. Les cellules dendritiques sont un élément clé de la réponse immunitaire dirigée contre le CMVH, mais sont également une des cibles du virus. En étudiant le niveau d'expression de molécules de co-stimulation (B7.1 et B7.2), de maturation (CD83) et des molécules du CMH, nous avons montré que les modifications phénotypiques de cellules dendritiques immatures secondaires à l'exposition au virus varient en fonction de l'inoculum viral. Les conséquences phénotypiques de l'infection de polynucléaires neutrophiles par des souches cliniques de CMVH ont également été étudiées. Les polynucléaires neutrophiles sont un des vecteurs de dissémination virale au cours de l'infection active et sont capables de capter et de transmettre le virus par interactions directes de cellule à cellule. Nous avons observé des modifications du niveau d'expression de certaines intégrines leucocytaires (CDllb, CDllc et CD18) impliquées dans les mécanismes d'adhésion des polynucléaires neutrophiles. L'ensemble de ces résultats contribue à l'exploration des différents facteurs de pathogénicité au cours de l'infection à CMVH.aHuman cytomegalovirus is an ubiquitous member of the Herpesviridae family. Its pathogenicity is highly correlated with the efficacy of the immune response during active infection. HCMV has the largest genome among the herpesviruses, and it encodes a large number of proteins involved in the modulation of immune responses. There is a high percentage of sequence homology between the clinical strains, but some regions of the genome involved in cell tropism or immune modulation mechanisms are characterised by genetic polymorphism. Genetic polymorphism of three viral genes (IE1, UL22A and UL55) was studied in a large patient population. Phylogenetie analysis of the UL22A gene, which encodes a secreted glycoprotein that binds to the CCL5 chemokine, differentiated three genetic clusters. The distribution of these clusters was not equal when comparing three patient groups: patients with HIV, allograft transplant recipients and immunocompetent subjects. Methods for the monitoring of HCMV replication (duplex PCR CMV/albumine) and transcription (IE1, UL22A and MCP RT PCR), based on real time technology, were developed in order to compare the behaviour of HCMV strains both in vivo and in vitro. We also developed a flow cytometry method for intracellular detection of viral antigens after virus exposure of different cell types. The replication kinetics of two HCMV strains (TB40E and VHLE), characterised by their endothelial tropism, was studied in infected fibroblasts and dendritic cells. Dendritic cells are a key element of the immune response directed against HCMV during the early stages of active infection. Expression of the co-stimulatory molecules (B7.1 and B7.2), the maturation marker (CD83) and MHC class I molecules was shown to be modified after infection with either TB40E or VHLE strains and we observed variations in these modifications depending on the initial viral inoculum. We also studied phenotypic modifications on polymorphonuelear cells infected with clinical strains. Polymorphonuclear cells are involved in the propagation of the virus during active infection. Viral particle uptake by these cells is mediated by direct interaction with other infected cells and involves adhesion mechanisms. We observed alterations in the expression of certain adhesion molecules (CD lib, CD lie and CD 18) subsequent to polymorphonuelear cell infection. All together, these results contribute to the exploration of factors that could influence viral pathogenesis.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocSudocFranceF

Cytomegalovirus et Herpesvirus Humain de type 6 (étude de leur réplication au sein du système hématopoïétique)

Le Cytomégalovirus humain (CMVH) et l'Herpèsvirus humain de type 6 (HHV6) sont deux ?- Herpesvirinae présentant un tropisme majeur pour le système hématopoïétique. Ce travail a visé à évaluer leurs capacités de réplication au cours de la différenciation hématopoïétique. Des outils méthodologiques autorisant la mise en évidence de la réplication virale ont été développés, permettant la détection de transcrits viraux tardifs par RT-PCR. Parmi les marqueurs développés pour le CMVH, l'ARNm tardif UL22, issu d'un épissage, a montré son intérêt, en particulier dans le cadre du diagnostic de l'infection active/maladie à CMVH. Pour l'HHV6, la détection du transcrit tardif multi-épissé de la gp 82-105 (U100) et la mise en évidence en cytométrie de flux d'antigènes nucléaires tardifs ont été développés à partir de cultures de souches virales de variant B. Ces essais ont permis de préciser que la forme épissée du gène U100 est exprimée en phase tardive du cycle de réplication, alors que la forme non épissée est un marqueur de la phase précoce. La possibilité de survenue d'une réplication des deux virus au cours de l'expansion ex vivo de 10 prélèvements de cellules souches hématopoïétiques CD34+ périphériques, a ensuite été envisagée. Ces essais ont été réalisés dans le cadre d'une nouvelle approche thérapeutique, qui vise à réduire la durée d'aplasie, chez des sujets traités par hautes doses de chimiothérapie, grâce à l'injection de cellules souches différenciées in vitro. Les cultures ont été menées en milieu liquide, en présence de cytokines permettant d'engager la différenciation vers les lignées myéloïdes et monocytaires. Parmi les quatre cultures de cellules provenant de patients séropositifs pour le CMVH, aucun marqueur de réactivation virale n'a été détecté. A l'inverse, dans 5/10 cultures issues de prélèvements effectués chez les patients séropositifs pour l'HHV6, le transcrit U100 a été amplifié. Ces données montrent pour la première fois et sans avoir recours à une infection préalable par une souche virale, une réplication de l'HHV6 due à une réactivation au cours de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques. Ces résultats originaux soulèvent le problème de la sécurité virale lors des réinjections chez des patients immunodéprimés de cellules supportant une réplication de l'HHV6.Cytomegalovirus (CMV) and Human Herpesvirus 6 (HHV6) were two ? -Herpesvirus with a major tropism for hematopoietic system. Since their interactions with hematopoiesis are still poorly understood, we evaluated their replication capacity during differenciation of hematopoietic stem cells. We first developed and evaluated tools to follow viral replication, by detection of late viral transcripts, which assess occurrence of a complete replication cycle. Among the CMV transcripts amplified by reverse transcription-PCR, the late spliced UL22 mRNA was of particular interest, notably to predict the occurrence CMV disease during active infection. For HHV6, a one-step RT-PCR amplifying the late alternatively U100 gene encoding the gp 82-105 glycoprotein and a flow cytometry method to analyse nuclear late antigens were developed from reference strains cultures. Evaluation of these methods was then realized during a sequential culture of HST strain on MT4 cells. This allows to specify that the U100 gene splicing starts at a late stage of multiplication whereas unspliced forms were detectable earlier in the cycle. We then evaluated the occurrence of viral replication during ex vivo expansion of 10 peripheral hematopoietic stem cells (CD34+) samples. Cultures were maintained in a serum free liquid medium supplemented with cytokines of myeloid-monocyte lineage. Neither CMV DNA nor CMV UL22 or UL86 mRNA were detected among the 4 cultures from CMV seropositive patients. Conversely, the late alternatively spliced U100 mRNA (HHV6) was detected at day 14 or 21 in 5/10 cultures from HHV6 seropositive patients. Our data demonstrated for the first time that HHV6 could enter in a replicative cycle during hematopoietic differenciation in the absence of in vitro infection of cells. This also raised the question of the viral safety of the infusion of ex-vivo expanded CD34-positive PBPCs.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Rôle de l'antibiothérapie et des facteurs liés à l'hôte et à l'hospitalisation sur le risque de colonisation et d'infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques

L'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques est devenue un problème majeur de santé publique, notamment en milieu hospitalier. De nombreuses données épidémiologiques établissent un lien entre antibiothérapie et infections causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nous avons initialement réalisé deux études épidémiologiques sur des souches cliniques d Escherichia coli dans le but de préciser le rôle de l antibiothérapie mais aussi des facteurs liés à l hôte et à l hospitalisation. Ces études ont permis de montrer une association significative entre l exposition à un antibiotique et l immunodépression et l isolement d une souche résistante. En particulier, l exposition à une b-lactamine était associée à la résistance à l amoxicilline et aux céphalosporines de 3ème génération (C3G) et l exposition aux fluoroquinolones et au cotrimoxazole était respectivement associée à la résistance à ces molécules. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude prospective de la flore digestive de 933 patients hospitalisés dans cinq services différents du CHU de Nantes, incluant des services de médecine, chirurgie et de réanimation dans le cadre d un Programme Hospitalier de Recherche Clinique national. Aucun entérocoque résistant à la vancomycine n a été détecté, 585 patients étaient colonisés par une entérobactérie résistante à l amoxicilline, parmi lesquelles 9,4% étaient résistantes aux C3G et 4,8% résistantes à l ofloxacine. Cent quatre vingt quinze patients étaient colonisés par Pseudomonas aeruginosa, dont 23% à l admission. L exposition aux antibiotiques était impliquée dans chacune des résistances observées. L antécédent d hospitalisation ou l hospitalisation dans certains services étaient également des facteurs de risque associés à l isolement de souches résistantes. Les études de flore sont de réalisation et d interprétation délicates mais s avèrent intéressantes dans des situations épidémiques ou dans des contextes de surveillance épidémiologique ciblée.Antimicrobial resistance is a major heath problem, especially in hospital-acquired infections. Many epidemiological data showed an association between antibiotic use and infection caused by antibiotic-resistant bacteria. To assess the impact of antibiotic use and other factors, we performed two epidemiological studies on clinical Escherichia coli strains isolated from hospital patients. We showed a significant association between antibiotic use and immunosuppression and infection caused by resistant E. coli. Previous use of b-lactamine was associated with amoxicillin- and third generation cephalosporin resistance, and previous use of fluoroquinolones and cotrimoxazole was associated with strains resistant to those antibiotics. In a second time, we performed a prospective study of the gut flora of 933 patients hospitalised in five different wards, including medicine and surgery wards and intensive-care units. No vancomycin-resistant Enterococci was isolated. 585 patients were colonised by an amoxicillin-resistant Enterobacteriaceae, with third generation cephalosporin- and ofloxacin resistance rates of 9.4% and 4.8%, respectively. One hundred and ninety five patients were colonized by Pseudomonas aeruginosa (23% on admission). Antibiotic use was implicated in all observed resistances. Previous hospital stay and hospitalisation in specific wards were also associated with antibiotic resistance. Studies of intestinal microflora are difficult to perform but are useful in epidemic situations and in target resistance surveillance programs.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Rôle de l'antibiothérapie et des facteurs liés à l'hôte et à l'hospitalisation sur le risque de colonisation et d'infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques

L'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques est devenue un problème majeur de santé publique, notamment en milieu hospitalier. De nombreuses données épidémiologiques établissent un lien entre antibiothérapie et infections causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nous avons initialement réalisé deux études épidémiologiques sur des souches cliniques d Escherichia coli dans le but de préciser le rôle de l antibiothérapie mais aussi des facteurs liés à l hôte et à l hospitalisation. Ces études ont permis de montrer une association significative entre l exposition à un antibiotique et l immunodépression et l isolement d une souche résistante. En particulier, l exposition à une b-lactamine était associée à la résistance à l amoxicilline et aux céphalosporines de 3ème génération (C3G) et l exposition aux fluoroquinolones et au cotrimoxazole était respectivement associée à la résistance à ces molécules. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude prospective de la flore digestive de 933 patients hospitalisés dans cinq services différents du CHU de Nantes, incluant des services de médecine, chirurgie et de réanimation dans le cadre d un Programme Hospitalier de Recherche Clinique national. Aucun entérocoque résistant à la vancomycine n a été détecté, 585 patients étaient colonisés par une entérobactérie résistante à l amoxicilline, parmi lesquelles 9,4% étaient résistantes aux C3G et 4,8% résistantes à l ofloxacine. Cent quatre vingt quinze patients étaient colonisés par Pseudomonas aeruginosa, dont 23% à l admission. L exposition aux antibiotiques était impliquée dans chacune des résistances observées. L antécédent d hospitalisation ou l hospitalisation dans certains services étaient également des facteurs de risque associés à l isolement de souches résistantes. Les études de flore sont de réalisation et d interprétation délicates mais s avèrent intéressantes dans des situations épidémiques ou dans des contextes de surveillance épidémiologique ciblée.Antimicrobial resistance is a major heath problem, especially in hospital-acquired infections. Many epidemiological data showed an association between antibiotic use and infection caused by antibiotic-resistant bacteria. To assess the impact of antibiotic use and other factors, we performed two epidemiological studies on clinical Escherichia coli strains isolated from hospital patients. We showed a significant association between antibiotic use and immunosuppression and infection caused by resistant E. coli. Previous use of b-lactamine was associated with amoxicillin- and third generation cephalosporin resistance, and previous use of fluoroquinolones and cotrimoxazole was associated with strains resistant to those antibiotics. In a second time, we performed a prospective study of the gut flora of 933 patients hospitalised in five different wards, including medicine and surgery wards and intensive-care units. No vancomycin-resistant Enterococci was isolated. 585 patients were colonised by an amoxicillin-resistant Enterobacteriaceae, with third generation cephalosporin- and ofloxacin resistance rates of 9.4% and 4.8%, respectively. One hundred and ninety five patients were colonized by Pseudomonas aeruginosa (23% on admission). Antibiotic use was implicated in all observed resistances. Previous hospital stay and hospitalisation in specific wards were also associated with antibiotic resistance. Studies of intestinal microflora are difficult to perform but are useful in epidemic situations and in target resistance surveillance programs.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF