Characterization and phenotyping of human IL-21 producing CD4+ T-lymphocytes

CD4+ T-Zellen sind essentiell an der Koordination des Immunsystems beteiligt. Es gibt unterschiedlichen Subsets der CD4+ T-Zellen wie Th1, Th2 und Th17 Zellen, die ihre Aufgaben unter anderem durch die Produktion von Zytokinen verwirklichen, die die Aktivität der anderen Zellen regulieren. Sowie die Abwesenheit einzelner Zytokine oder der zugehörigen Rezeptoren verheerende Folgen für die Immunlage der Betroffenen haben können, so kann auch eine pathologische Überproduktion zur Entstehung von Pathologien wie Autoimmunkrankheiten führen. Für die Medizin spielen Zytokine eine wichtige Rolle, da sie als Therapien gegen Viruserkrankungen oder Krebsleiden eingesetzt werden können, gegen die das Immunsystem alleine nicht ankämpfen kann. Auf der anderen Seite kann die therapeutische Neutralisierung bestimmter Zytokine ein pathologisches Überschießen des Immunsystems unterdrücken oder zu mindestens aufhalten. Viele Zytokine sind bereits gut erforscht und werden bereits erfolgreich eingesetzt. Es werden jedoch ständig bisher unbekannte Zytokine entdeckt, deren Biologie noch erforscht werden muss. Dazu gehört das Interleukin 21 (IL-21) und sein Rezeptor (IL-21R), welche vor 10 Jahren entdeckt wurden. Seit dem wurde herausgefunden, dass dieses Zytokin von CD4+ T-Zellen und NKT Zellen produziert wird. Es ist von großer Bedeutung für die Regulation von B-Zellen und deren Antikörperproduktion sowie für die Aktivität und Effizienz von CD8+ zytotoxischen T-Zellen, besonders bei der Abwehr gegen chronische Virusinfektionen. IL-21 befindet sich bereits in klinischen Studien der Phase II, in denen seine Wirkung als Antitumoragens erprobt wird, in Mausexperimenten konnte bereits eine Antitumorwirkung nachgewiesen werden. Gleichzeitig steht IL-21 auch im Verdacht, an der Entstehung und dem Verlauf von Autoimmunkrankheiten wie Multipler Sklerose, Psoriasis, Diabetes Mellitus Typ I und Systemischem Lupus erythematodes beteiligt zu sein. Unklarheit herrscht jedoch immer noch darüber, ob ein eigenes Subset von CD4+ T-Zellen für die Produktion dieses Zytokins verantwortlich ist und welche Faktoren zu dessen Expression führen. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass Th1, Th2 und Th17 Zellen IL-21 produzieren, aber auch ein eigenes Subset von follikulären Helfer T-Zellen per IL-21 Produktion B-Zellen stimuliert. Für das Maussystem konnte bereits gezeigt werden, dass IL-6 und IL-21 selbst die Expression von IL-21 in naiven ex vivo stimulierten CD4+ T-Zellen induzieren können, während TGF-β dieselbe hemmt. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass alle Subsets von CD4+ Helfer T-Zellen, wenn auch in unterschiedlichem Maße, zur Produktion von IL-21 ex vivo im Stande sind. IL-21 ist nach IFN-γ das am häufigsten produzierte Effektorzytokin ex vivo stimulierter CD4+ Gedächtnis T-Zellen des peripheren Blutes, und das am häufigsten produzierte Effektorzytokin ex vivo stimulierter antigenerfahrener CD4+ T-Zellen der Tonsille. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auch in humanen CD4+ naiven T-Zellen IL-6 und IL-21 die IL-21 Produktion induzieren. Zusätzlich wurde für die Zytokine IL-12 und IL-10 die gleiche Wirkung nachgewiesen. IL-12 erhöhte sowohl die Anzahl der IL-21 Produzenten, als auch der IFN-γ Produzenten und der IL-21/IFN-γ Koproduzenten. Dagegen führte die Zugabe von IL-6, IL-10 und IL-21 zu einer alleinigen Erhöhung der IL-21 Produktion, für IL-6 und IL-21 konnte sogar ein hemmender Effekt auf die IFN-γ Produktion beobachtet werden. Überraschender Weise konnte festgestellt werden, dass es unter nicht polarisierenden Bedingungen zu einer donorabhängigen Spontanproduktion von IL-21 in in vitro stimulierten naiven CD4+ T-Zellen des peripheren Blutes Erwachsener kommt. IL-6 kann in Donoren, die bereits in der neutralen Kondition einen Anteil von IL-21 Produzenten von über 10% aufweisen, keine weitere Erhöhung der IL-21 Produktion induzieren, IL-12 hingegen führt unabhängig von der Spontanproduktion unter nichtpolarisierenden Bedingungen immer zu einer Erhöhung der Anzahl von IL-21 Produzenten auf durchschnittlich 32%. Dies trifft jedoch nur auf Zellen des peripheren Blutes (PBZ) Erwachsener Spender zu. In Zellen, die aus Nabelschnurblut Neugeborener (CBZ) isoliert wurden, konnte erstens keine Spontanproduktion beobachtet werden und die Zugabe von IL-12 konnte zweitens den Anteil an IL-21 Produzenten auf durchschnittlich nur 7% erhöhen. Weitere Unterschiede zwischen PBZ und CBZ betreffen die Wirkung von IL-6 und IL-21 auf die IFN-γ Produktion in vitro stimulierter naiver CD4+ T-Zellen, die gegensätzlich ist. Schließlich konnte die induzierende Wirkung von IL-10 auf die IL-21 Produktion in CBZ nicht bestätigt werden. Die Mechanismen, die zu genannter Spontanproduktion führen, konnten in dieser Arbeit nicht identifiziert werden, sie bietet jedoch einen Ausgangspunkt für folgende Forschungsarbeiten, die zur Ergründung dieses Phänomens führen können.CD4+ T-cells essentially participate in the coordination of the immune system. Different subsets of CD4+ T-cells have been identified such as Th1, Th2 or Th17 cells. They realize their function by producing cytokines that regulate the activity of other immune cells. The absence of single cytokines or their receptor can lead to fatal dysfunciton of the immune system. On the other hand the pathological overproduction of cytokines can lead to the development of autoimmune diseases. The therapeutic admission of cytokines is used to treat viral infections or malignant neoplasias while the neutralization of cytokines can inhibit the pathological effect seen in autoimmune diseases. Many cytokines have been well explored and they are part of different therapies. While the biologiy of recently discovered cytokines is yet to be understood. One of these newer cytokines is the interleukin 21 (IL-21), which has been discovered over 10 years ago. Since then it has become clear that the main producers of IL-21 are CD4+ T-cells and NKT-cells. Its importance lies in the regulation of B-cell proliferation, differentiation and antibody production, as well as CD8+ cytotoxic T-cell aktivity and effectivnes especially for the defense against chronic viral infections. IL-21 has entered clinical trials as an anti tumor agent. In mouse experiments it has been shown that IL-21 can reduce tumor size and inhibt further growth. At the same time IL-21 is suspected to take part in the development and progression of autoimmune diseases like multiple sklerosis, psoriasis, diabetes mellitus type I and systemic lupus erythematodes. It is yet unclear if a single subset of CD+ T-cells is responsible for the production of this cytokine and which determining factors lead to its expression. Different studies have shown that Th1, Th2 and Th17 cells as well as follicular T helper cells produce IL-21. In mice IL-6 and IL-21 induce IL-21 expression in ex vivo stimulated CD4+ T-cells while TGF-β has inhibiting effects. Here it was possible to show that all subsets of CD4+ T-cells are able to produce IL-21 ex vivo even though to different extents. Second to IFN- γ IL-21 is the most frequently produced effector cytokine of ex vivo stimulated CD4+ memory T-cells of the peripheral blood and the most frequently produced effector cytokine of ex vivo stimulated antigen experienced CD4+ T-cells extracted from human tonsils. Furthermore it has been shown that in human CD4+ naive T-cells IL-21 expression is induced by IL-6 and IL-21 itself. The same effect could be demonstrated for the cytokines IL-12 and IL-10. The addition of IL-12 leads to a greater percentage of IL-21 producers as well as IFN- γ and IL-21/IFN- γ coproducers. While IL-6, IL-10 and IL-21 increased only IL-21 single producing cells. For IL-6 and IL-21 an inhibitory effect on the IFN- γ production could be shown. Surprisingly, spontaneous IL-21 expression occured in in vitro stimulated naive CD4+ T-cells of the peripheral blood of adults that were stimulated under non-polarizing conditions. This effect was donor dependend. In donors that show spontaneous IL-21 production greater than 10% IL-6 had no further increasing effect on IL-21 production. IL-12 on the other hand was allways able to induce IL-21 production independently of spontaneous IL-21 expression to an average of 32%. These findings were made in cells of the peripheral blood of adults (PBC). In cells that were extracted from cord blood of new borns (CBC) no spontaneous IL-21 production could be observed and IL-12 had a much lighter effect on IL-21 induction, to an average of 7%. Other differences between PBC and CBC involve the IFN- γ inhibiting effect of IL-6 and IL-21 which was absent in CBC. Also the IL-21 inducing effect by IL-10 could not be confirmed in CBC. Here, the mechanisms that lead to spontaneous IL-21 production have not been identified but this work can be the starting point of further experiments conducting this phenomenon