КІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ NO-СИНТАЗИ СПЕРМАТОЗОЇДІВ ІНФЕРТИЛЬНИХ ЧОЛОВІКІВ

Introduction. Nitrogen (II) oxide (NO) is a highly reactive molecule involved in the regulation of numerous biochemical processes and physiological functions. The role of NO/NO-synthase of spermatozoa in the NO/NOS system of sperm cells in male infertility is widely studied. Previously, we found redistribution of activities in the NO-synthase system with their shift toward Ca2+-independent inducible isoform, which indicates dismetabolic changes in NO synthesis, namely its hyperproduction. However, it is unclear which biochemical mechanisms cause a disturbance of functional activity of NOS. The aim of the study – to learn the kinetic properties of NOS isoforms of spermatozoa in fertile and infertile men with different forms of pathospermia. Research Methods. Studies were conducted on sperm cells from men who had undergone a primary examination related to infertility. The WHO criteria (2010) were used in this work to assess morphological characteristics of spermatozoa. The NOS activity was determined by the formation of L-citrulline by a highly specific method of color reaction with antipyrine. The study of the kinetic properties of NOS was carried out in a standard incubation medium that was modified by substrate concentration. The imaginary kinetic parameters characterizing the NOS reaction were calculated in the Lineweaver-Burk plot. Results and Discussion. The value of the initial maximum activity of cNOS in the spermatozoa of asthenozoospermic men was 1.5 fold (р<0.001) lower than this value in fertile men with normozoospermia. At the same time, there was no statistically significant difference in the value of the initial maximal activity of the enzyme between the normo- and oligozoospermic samples. The value of the apparent affinity constant of cNOS to L-arginine in spermatozoa from infertile men was 1.6–2.7 fold higher than that in normozoospermic men, indicating a decrease in the affinity of enzyme to L-arginine in pathospermic men. The value of the initial maximal activity of iNOS in pathospermic men exceeds this value for cNOS in 1.7–2.3 fold. Conclusions. The obtained results indicate that in case of oligozoospermy the inhibition of cNOS activity is due to the increase in enzyme affinity to the substrate. In the case of asthenozoospermia the inhibition of cNOS activity is due to the decrease of the enzyme affinity to the substrate and decrease in enzyme rate.Вступление. Нитроген (ІІ) оксид азота (NO) является высокореакционноспособной, молекулой, которая участвует в регуляции практически всех биохимических процессов и физиологических функций. Роль системы NO/NO-синтаза (NOS) сперматозоидов при мужскоv бесплодии широко изучают с целью выяснения регуляторных механизмов, которые ведут к развитию этой патологии. Ранее было установлено, что у бесплодных мужчин с различными формами патоспермии происходит перераспределение активности в системе NO-синтаз со сдвигом в сторону Са2+-независимой индуцибельной изоформы, что свидетельствует о дисметаболических изменениях в системе синтеза NO, в частности о его гиперпродуцировании. Однако достоверно неизвестно, какие биохимические механизмы обусловливают нарушения функциональной активности отдельных изоформ NOS.  Цель исследования – изучить кинетические свойства отдельных изоформ NO-синтазы сперматозоидов фертильных и инфертильных мужчин с различными формами патоспермии.  Методы исследования. Исследования проводили на сперматозоидах мужчин, проходивших первичное обследование в связи с бесплодием. В работе использовали критерии ВОЗ (2010) для оценки морфологических характеристик сперматозоидов. Активность NOS определяли высокоспецифичным методом по образованию L-цитруллина, в цветной реакции с антипирином. Кинетические свойства NOS изучали в стандартной среде инкубации, модифицированной по концентрации субстрата. Мнимые кинетические параметры, характеризующие NOS-реакцию, рассчитывали в координатах Лайнуивера – Берка.  Результаты и обсуждение. Значение начальной максимальной активности cNOS в сперматозоидах астенозооспермичных мужчин в 1,5 раза (р<0,001) ниже относительно этой величины у фертильных мужчин с нормозооспермией. В то же время не отмечено статистически достоверной разницы в величине начальной максимальной скорости ензиматичной реакции между нормо- и олигозооспермичными образцами. Значение мнимой константы аффинности cNOS к L-аргинину в сперматозоидах инфертильных мужчин в 1,6–2,7 раза превышало этот показатель в сперматозоидах мужчин с нормозооспермией что свидетельствовало о снижении сродства энзима к L-аргинину при патоспермии. Значение начальной максимальной скорости NO-синтазной реакции у мужчин с патоспермией было больше от этого показателя для cNOS в 1,7–2,3 раза. Вывод. При олигозооспермии активность cNOS подавляется за счет роста аффинности к субстрату реакции, а при астенозооспермии – в результате как снижения сродства энзима к субстрату, так и уменьшения числа оборотов энзима.Вступ. Нітроген (ІІ) оксид (NO) є високореакційноздатною молекулою, що бере участь у регуляції практично всіх біохімічних процесів і фізіологічних функцій. Роль системи NO/NO-синтаза (NOS) сперматозоїдів при чоловічій неплідності широко вивчають з метою з’ясування регуляторних механізмів, що призводять до розвитку цієї патології. Раніше було встановлено, що в неплідних чоловіків з різними формами патоспермії відбувається перерозподіл активності в системі NO-синтаз із зсувом у бік Са2+-незалежної індуцибельної ізоформи, що свідчить про дисметаболічні зміни в системі синтезу NO, зокрема про його гіперпродукування. Однак достовірно невідомо, які біохімічні механізми зумовлюють порушення функціональної активності окремих ізоформ NOS.  Мета дослідження – вивчити кінетичні властивості окремих ізоформ NO-синтази сперматозоїдів фертильних та інфертильних чоловіків з різними формами патоспермії.  Методи дослідження. Дослідження проводили на сперматозоїдах чоловіків, які проходили первинне обстеження у зв’язку з неплідністю. У роботі використовували критерії ВООЗ (2010) для оцінки морфологічних характеристик сперматозоїдів. Активність NOS визначали високоспецифічним методом за утворенням L-цитруліну, в кольоровій реакції з антипірином. Кінетичні властивості NOS вивчали в стандартному середовищі інкубації, модифікованому за концентрацією субстрату. Уявні кінетичні параметри, що характеризують NOS-реакцію, розраховували в координатах Лайнуївера – Берка.  Результати й обговорення. Значення початкової максимальної активності cNOS у сперматозоїдах астенозооспермічних чоловіків в 1,5 раза (р<0,001) нижче щодо цієї величини у фертильних чоловіків з нормозооспермією. Водночас не відмічено статистично достовірної різниці у величині початкової максимальної швидкості ензиматичної реакції між нормо- та олігозооспермічними зразками. Значення уявної константи афенності cNOS до L-аргініну в сперматозоїдах інфертильних чоловіків в 1,6–2,7 раза перевищувало цей показник у сперматозоїдах чоловіків з нормозооспермією, що свідчило про зниження спорідненості ензиму до L-аргініну при патоспермії. Значення початкової максимальної швидкості NO-синтазної реакції в чоловіків з патоспермією було більшим від цього показника для cNOS в 1,7–2,3 раза. Висновок. При олігозооспермії активність cNOS пригнічується за рахунок зростання афінності до субстрату реакції, а при астенозооспермії – в результаті як зниження спорідненості ензиму до субстрату, так і зменшення числа обертів ензиму

The kinetic properties of arginase in sperm cells of inferile men

Nowadays the role of NO in the development of male infertility is actively studied. Arginase (EC 3.5.3.1) is a manganese metalloenzyme which converts L-arginine to L-ornithine and urea and reciprocally regulates NO production. Although arginase activity has usually been detected in the reproductive tract, including spermatozoa, no data relating to the kinetic properties of the enzyme in ejaculated spermatozoa has been reported. This study was designed to study the kinetic parameters of arginase of spermatozoa of infertile men. Spermatozoa arginase activity was measured by determining levels of urea production. Kinetic analysis of the enzyme reaction was performed in a standard incubation system with modified physical and chemical characteristics or the respective components (the substrate concentration, Mn2+ concentration, incubation time and protein content). Pathobiochemical and kinetic properties of sperm arginase obtained from human normozoo- and pathospermic samples were compared. The maximum rate of L-arginine hydrolysis (detrermined by L-arginine) for arginase of spermatozoa obtained from men with preserved fertility was 2.0, 1.8 and 1.9 times greater than this value for oligo-, astheno- and oligoasthenozoospermic samples respectively. However, affinity constants for L-arginine was not significantly different between fertile and infertile men. The maximum rate of L-arginine hydrolysis (deretmined by Mn2+) for arginase of spermatozoa obtained from men with preserved fertility was 1.6, 1.7 and 1.7 times greater than this value for oligo-, astheno- and oligoasthenozoospermic samples respectively. However, affinity constants for Mn2+ were not significantly different between fertile and infertile men. In the whole range of time, the urea production by arginase in sperm cells obtained from oligozoospermic samples is much lower compared to value in healthy donors. The results of kinetic analysis indicate that urea production by arginase is much more intense in the control group than in patients with various forms of pathospermia. The initial (instantaneous) reaction rate of arginase reaction was lower for oligozoospermic samples compared to normozoospermic samples. It has been found that inhibition of arginase activity in sperm cells of infertile men occurs by non-competitive type and was related to marked decrease in maximum reaction rate while affinity of arginase to L-arginine and Mn2+ was unaffected

Активність глутатіонзалежних ензимів сперматозоїдів за умов патоспермії

The results of glutathione peroxidase and glutathione reductase activity in spermatozoa of patients with different forms pathospermia are presented in the paper. It was shown that glutathione peroxidase and glutathione reductase activity in sperm cells of patients is reduced in comparison with healthy men with preserved fertility. However, the most expressed changes in the activity of glutathione peroxidase and glutathione reductase are in spermatozoa of infertile men with associated forms patospermia and leucospermia. These changes indicate exhaustion of compensatory mechanisms of glutathione antioxidant system in the sperm cells of infertile men with pahospermia.В статье приведены результаты определения активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы сперматозоидов мужчин с различными формами патоспермии. Результаты исследований показали, что во всех группах активность энзимов снижается относительно величин у здоровых мужчин с сохраненной фертильностью. Однако наиболее выраженные изменения активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы сперматозоидов отмечают у бесплодных мужчин с сочетанными формами патоспермии и лейкоцитоспермией. Данные изменения указывают на истощение компенсаторных механизмов глутатионовой антиоксидантной системы в сперматозоидах бесплодных мужчин в условиях патоспермий.У статті наведено результати визначення активності глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази сперматозоїдів чоловіків із різними формами патоспермії. Результати досліджень показали, що в усіх групах активність ензимів знижується стосовно величин у здорових чоловіків із збереженою фертильністю. Проте найбільш виражені зміни активності глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази сперматозоїдів відмічаються в неплідних чоловіків з поєднаними формами патоспермії та лейкоцитоспермією. Дані зміни вказують на виснаження компенсаторних механізмів глутатіонової антиоксидантної системи у сперматозоїдах неплідних чоловіків за умов патоспермій

Effect of hydrogen peroxide on Na+,K+-ATPase activity in spermatozoa of infertile men

Na+,K+-ATPase plays an essential role in sperm motility, hyperactivation, chemotaxis, acrosome reaction etc. Na+,K+-ATPase is sensitive to ROS insult. Apart from production of highly reactive molecules, H2O2 can exert a number of direct effects on cells, their metabolism and enzymes. In the present study, exposure to exogenous H2O2 was used to characterize the effects of H2O2 on Na+,K+-ATPase activity in spermatozoa of infertile men with different forms of pathospermia. It was shown that Na+,K+-ATPase activities in spermatozoa of infertile men with different forms of pathospermia were inhibited by exposure to H2O2 (50−500 μM). H2O2, one of the most toxic oxygen species, has the ability to depress Na+,K+-ATPase activity in a dose-dependent manner. Severe inhibition of the hydrolytic activity was observed when higher H2O2 were used. The time course of incubation with 100 μM H2O2 showed a sharp decrease in the enzyme activity during the first 5 min of incubation for both normozoospermic and pathozoospermic men. The enzymatic activity of Na+,K+-ATPase in the sperm was completely destroyed at 20 min for asthenozoospermic men and 30 min for normozoospermic men. We show that an administation of H2O2 inhibited Na+,K+-ATPase activity in normozoospermic samples with IC50 of 106.6 ± 7.9 μM. IC50 for patients with asthenozoospermia was two times less than for healthy men with preserved fertility. For other studied groups, the differences in IC50 were not significant. These observations suggest that Na+,K+-ATPase in pathozoospermic samples is more vulnerable to H2O2-induced damage than in normozoospermic men. The Hill coefficient was significantly increased only for patients with asthenozoospermia, indicating increased positively cooperative binding. The decreases in Na+,K+-ATPase hydrolase activity in H2O2-treated sperm cells in men with normozoospermia were largely attenuated by exogenous GSH at 5 mM. This suggests that GSH partially protects the Na+,K+-ATPase from inhibition under experimental oxidative stress. However, treatment of oligo-, astheno- and oligoasthenozoospermic samples with 100 μM H2O2 and 5 mM GSH did not result in protection of Na+,K+-ATPase against induced oxidation, suggesting that the impaired Na+,K+-ATPase in pathozoospermic samples appears to be an irreversible event. In contrast, presence of GSH only after H2O2 treatment does not reverse Na+,K+-ATPase inhibition. This study has provided a deeper insight into the role Na+,K+-ATPase plays in sperm cells,it also could offer clues to the clinical application of antioxidant therapy in male infertility therapy

Glutathione antioxidant protection system in ejaculated spermatozoa of infertile men with different forms of pathospermia

The level of the products of lipid peroxidation measured as the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and activity of enzymes of glutathione antioxidant protection system in spermatozoa were studied. It was shown that mean levels of TBARS in sperm cells of infertile men with oligozoo-, astenozoo-, oligoastenozoo- and leucocytospermia were 1.6-, 2.0-, 2.0- and 2.7-fold higher, respectively, compared with such levels in the fertile men. The glutathione peroxidase activity was decreased 2.2-fold in patients with oligozoospermia, 2.8-fold in patients with astenozoo- and oligoastenozoospermia and 3.8-fold in patients with leucocytospermia. It was found that glutathione reductase activity in patients with oligozoo-, astenozoo-, oligoastenozoo- and leucocytospermia were 2.3-, 1.6-, 1.7- and 3.3-fold lower than that in normozoospermic men, respectively. In addition, the glutathione transferase activity was decreased 1.8–2.1-fold in patients with oligozoo-, astenozoo- and oligoastenozoospermia and 5.0-fold in patients with leuco­cytospermia in comparison with healthy donors. The most significant changes were observed in the infertile men with leucocytospermia. This manifestation could be explained by the fact that white blood cells stimulate the formation of reactive oxygen species, induction and development of oxidative stress in sperm cells

Glutathione content in sperm cells of infertile men

Hyperproduction of reactive oxygen species can damage sperm cells and is considered to be one of the mechanisms of male infertility. Cell protection from the damaging effects of free radicals and lipid peroxidation products is generally determined by the degree of antioxidant protection. Glutathione is non-enzymatic antioxidant which plays an important protective role against oxidative damages and lipid peroxidation. The aim of the present work is to determine the content of reduced and oxidized glutathione in sperm cells of infertile men. Semen samples from 20 fertile men (normozoospermics) and 72 infertile patients (12 oligozoospermics, 17 asthenozoospermics, 10 oligoasthenozoosper­mics and 33 leucocytospermic) were used. The total, oxidized (GSSG) and reduced (GSH) glutathione levels were measured spectrophotometrically. The levels of total glutathione were significantly lower in the spermatozoa of patients with oligozoo-, asthenozoo- and oligoasthenozoospermia than in the control. Infertile groups showed significantly decreased values of reduced glutathione in sperm cells vs. fertile men, indicating an alteration of oxidative status. The oxidized glutathione levels in sperm cells of infertile men did not differ from those of normozoospermic men with proven fertility. The GSH/GSSG ratio was significantly decreased in the oligo-, astheno- and oligoasthenozoospermic groups compared to the normozoospermic group. In patients with leucocytospermia the GSH/GSSG ratio was lower but these changes were not significant. In addition, glutathione peroxidase activity in sperm cells was decreased in patients with oligozoo-, astenozoo-, oligoastenozoospermia and with leucocytospermia. The most significant changes in glutathione peroxidase activity were observed in infertile men with leucocytospermia. Decreased GSH/GSSG ratio indicates a decline in redox-potential of the glutathione system in sperm cells of men with decreased fertilizing potential. Redistribution between oxidized and reduced forms of glutathione can be caused by depletion of intracellular stores of glutathione and intensification of lipid peroxidation processes. This leads to increased production of reactive oxygen species, further depletion of antioxidant pools and disturbances of structure and function of spermatozoa. Our results indicate that the evaluation of reduced glutathione level and GSH/GSSG ratio in sperm cells of infertile men can be helpful in fertility assessment

Intensity of processes of lipid peroxidation in sperm of men with fertility breach

Вивчено інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів у сперматозоїдах неплідних чоловіків із різними формами патоспермій та досліджено кореляційний зв’язок між вмістом вторинних продуктів ліпопероксидації (ТБК-позитивних продуктів) та основними показниками сперматограм. Виявлено значне підвищення вмісту ТБК-позитивних продуктів за умов патоспермії. Виявлені тісні кореляційні зв’язки між вмістом ТБК-позитивних продуктів і ступенем вираженості морфофункціональних змін за умов патоспермії; Р. В., Онуфрович О. К., Ефремова У. П., Наконечный И. А., Воробец З. Д. Резюме. Изучены интенсивность процессов перекисного окисления липидов в сперматозоидах бесплодных мужчин с различными формами патоспермий и исследована корреляционная связь между содержанием вторичных продуктов липопероксидации (ТБК-положительных продуктов) и основными по- казателями сперматограмм. Выявлено значительное повышение содержания ТБК-положительных про- дуктов в условиях патоспермии. Обнаружены тесные корреляционные связи между содержанием ТБК- положительных продуктов и степенью выраженности морфофункциональных изменений в условиях патоспермии; It is well known that an imbalance between the activity of prooxidant and antioxidant systems leads to the accumulation of products of free radical peroxidation and development of oxidative stress, which is a potential precondition for the development of pathologies of different genesis. One of the most sensitive markers of lipid peroxidation and oxidative stress are thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Oxidative stress of sperm cells is closely related to the disturbances in their spermatogenesis, motility, acrosomal reaction and process of sperm-egg interaction which leads to significative reduction of fertility potential. The aim of present paper was to examine the intensity of lipid peroxidation processes in sperm cells of infertile men with different forms of pathospermia and to determine correlations between TBARS content and the nature of the pathological process. The data of 72 men aged 21-39 years with infertility under conditions pathospermia were analyzed. All patients were divided into 4 groups: patients with oligozoospermia, astenozoospermia, oligoastenozoospermia and leukocytospermia. The intensity of lipid peroxidation processes in sperm cells was evaluated by accumulation secondary products of lipid peroxidation. The statistically significant increase in TBARS content in sperm cells of infertile men compared with men with preserved fertility was found. A significant increase in TBARS content as secondary products of lipid peroxidation indicates an intensification of free radical processes. This is due to the increased level of reactive oxygen species or inhibition of the antioxidant defense system. As a result of the correlation analysis we found an inverse correlations between TBARS content in spermatozoa in infertile men and the number of sperm cells in the ejaculate, their motility, which indicates direct pathogenetic link between the level of lipid peroxidation and decrease in fertility potential. However, we have not found a clear correlation between TBARS content in sperm cells and the number of leukocytes in the ejaculate of patients with leukocytospermia. These results indicate a clear correlation between the intensity of free radical processes in sperm cells of infertile men and the changes in their morphological and functional characteristics. Determination of TBARS can be a useful diagnostic tool for determining potential fertility of sperm cells and can have practical implications for the treatment of male infertility, particularly in idiopathic cases