Multiplex PCR assay for detection of human interferon alpha2b gene in transgenic plants

During the last decade interferons are regarded as potent candidates for generation of plant-based edible vaccines because of broad spectrum of antiviral activities and adjuvant properties. Establishment and certification of numerous interferon producing plant systems requests development of fast and efficient multiplex PCR protocol for the transgene detection in GM plants. Here we represent a protocol for simultaneous amplification in one assay of fragments of hIFN alpha 2b gene and two control genes, namely virD1 of Agrobacterium tumefaciens and conservative region of plant actin gene.В последнее десятилетие интерфероны рассматриваются как перспективные кандидаты для получения из растений в виде съедобных вакцин, поскольку обладают широким спектром антивирусной активности и адъювантными свойствами. Создание и сертификация многочисленных растительных систем, продуцирующих рекомбинантный интерферон, делают актуальной разработку быстрого и эффективного протокола мультиплексной ПЦР для определения данного трансгена в генетически модифицированных растениях. В настоящей публикации мы приводим метод детекции гена человеческого интерферона альфа-2b в трансгенных растениях с помощью совместной амплификации в ходе одной реакции фрагментов гена hINTα2b и двух контрольных генов, virD1 Agrobacterium tumefaciens и консервативного участка гена актина растений.В останнє десятиліття інтерферони розглядаються як перспективні кандидати для отримання з рослин у вигляді їстівних вакцин оскільки, вони мають широкий спектр антивірусної активності й ад’ювантні властивості. Створення і сертифікація численних рослинних систем, які накопичують рекомбінантний інтерферон, роблять актуальною розробку швидкого й ефективного протоколу мультиплексної ПЛР для визначення даного трансгена в генетично модифікованих рослинах. В цій публікації ми наводимо метод детекції гена людського інтерферону альфа-2b у трансгенних рослинах за допомогою сумісної ампліфікації в ході однієї реакції фрагментів гена hINTα2b і двох контрольних генів, virD1 Agrobacterium tumefaciens і консервативної ділянки гена актину рослин

Creation of glyphosate-resistant Brassica napus L. plants expressing DesC desaturase of cyanobacterium Synechococcus vulcanus

Aim. Creation of glyphosate-resistant canola plants expressing bifunctional hybrid desC::licBM3 gene. In the hybrid gene the sequence of DesC desaturase of cyanobacterium S. vulcanus without plastid targeting was fused with the sequence of thermostable lichenase reporter LicBM3 gene. Methods. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation, PCR, quantitative and qualitative determination of lichenase activity, genetic analysis. Results. Transgenic canola plants, carring the enolpyruvat shikimat phosphate syntase gene (epsps), conferring on plants resistance to phosphonomethyl glycine herbicides (Roundup), as well as the desC::licBM3 gene, were selected. The presence of transgenes was confimed by multiplex PCR. The epsps gene expression in canola was shown at the transcription level, during in vitro growth and after greenhouse herbicide treatment. Activity of the licBM3 gene product as a part of hybrid protein allowed quantitative and qualiative estimation of the desaturase gene expression. Inheritance of heterologous genes and their expression in the first generation were investigated. Conclusions. Transgenic canola plants were obtained, the presence of trangenes in plant genome was proved and expression of the target genes was detected. Keywords: Brassica napus, desC, epsps, licBM3, lichenase.Цель. Создание растений рапса, устойчивых к глифосату и экспрессирующих бифункциональный гибридный ген desC::licBM3, в котором последовательность десатуразы DesC цианобактерии S. vulcanus без сигнала транспорта в пластиды слита с последовательностью гена репортерного белка термостабильной лихеназы LicB Clostridium thermocellum. Методы. Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация, ПЦР, качественное и количественное определение активности термостабильной лихеназы, генетический анализ. Результаты. Получены трансгенные растения рапса, несущие два целевых гена: енолпируватшикиматфосфатсинтазы (epsps), обеспечивающего устойчивость растений к гербицидам на основе фосфонометилглицина, и гена desC::licBM3. Присутствие трансгенов в геноме растений доказано методом мультиплексной ПЦР. Экспрессия гена epsps показана на уровне транскрипции, в условиях in vitro и in vivo (теплицa). Наличие продукта гена licBM3 в составе гибридного белка позволило оценить экспрессию слитого с ним гена десатуразы. Прослежено наследование введенных генов и их экспрессия в первом поколении. Выводы. Получены линии трансгенных растений рапса, подтверждено присутствие трансгенов в геноме растений и доказана экспрессия целевых генов. Ключевые слова: Brassica napus, epsps, desC, licBM3, лихеназа.Мета. Створення стійких до гербіциду Roundup рослин ріпаку, що експресують біфункціональний гібридний ген desC::licBM3, в якому послідовність десатурази DesC ціанобактерії S. vulcanus без сигналу транспорту в пластиди злита з послідовністю гена репортерного білка ліхенази LicBM3 Clostridium thermocellum. Методи. Agrobacterium tumefaciens-опосередкована трансформація, ПЛР, якісне і кількісне визначення активності термостабільної ліхенази, генетичний аналіз. Результати. Отримано трансгенні рослини ріпаку, які несуть два цільових гени: єнолпіруватшикі- матфосфатсинтази (epsps), що забезпечує стійкість рослин до гербіцидів на основі фосфонометилгліцину, і гена desC::licBM3. Присутність трансгенів у геномі рослин підтверджено методом мультиплексної ПЛР. Експресію гена epsps показано на рівні транскрипціі, за умов in vitro та in vivo (теплиця). Наявність продукту гена licBM3 у складі гібридного білка дозволила оцінити експресію злитого з ним гена десатурази. Простежено успадкування введених генів і їхня експресія в першому поколінні. Висновки. Отримано лінії трансгенних рослин ріпаку, підтверджено присутність трансгенів у геномі рослин і доведено експресію цільових генів. Ключові слова: Brassica napus, epsps, desC, licBM3, ліхеназа

Influence of exogenous phytohormones, methyl jasmonate and suppressors of jasmonate biosynthesis on Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana excelsior

Our aim was to investigate the influence of some exogenous agents on the recombinant protein accumulation in plants via Agrobacterium-mediated transient expression. Methods. Agrobacterium-mediated transient expression method, spectrophotometric methods for protein analysis, statistical calculations. Results. It was shown that the tested compounds in different concentrations (namely, auxins, cytokinin, methyl jasmonate and suppressors of jasmonate biosynthesis (phenidon and diethyldithiocarbamic acid)) added to the infiltration buffer did not influence either GFP transient expression nor total protein accumulation in plant tissue. Conclusions. The results suggest that the tested factors are not substantial for Agrobacterium-mediated transient expression. Keywords: Nicotiana excelsior, Agrobacterium, transient expression, GFP.Мета. Дослідження впливу деяких екзогенних агентів на накопичення рекомбінантного білка в рослинах за допомогою Agrobacterium-опосередкованої транзієнтної експресії. Методи. Agrobacterium-опосередкована транзієнтна експресія, спектрофотометричні методи для аналізу білків, статистичні розрахунки. Результати. Показано, що протестовані речовини, а саме – деякі концентрації ауксинів, цитокініну, метилжасмонату і супресорів його біосинтезу (фенідону і диетилдитіокарбамату), додані до інфільтраційного буфера, не впливають на транзієнтну експресію GFP і загальний рівень вмісту білка в рослинній тканині. Висновки. Результати свідчать, що протестовані фактори не є суттєвими для проведення Agrobacterium-опосередкованої транзієнтної експресії. Ключові слова: Nicotiana excelsior, Agrobacterium, транзієнтна експресія, GFP.Цель. Исследование влияния некоторых экзогенных агентов на накопление рекомбинантного белка в растениях с помощью Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии. Методы. Agrobacterium-опосредованная транзиентная экспрессия, спектрофотометрические методы для анализа белков, статистические расчеты. Результаты. Показано, что тестируемые вещества, а именно – некоторые концентрации ауксинов, цитокинина, метилжасмоната и супрессоров его биосинтеза (фенидона и диэтилдитиокарбамата), добавленные к инфильтрационному буферу, не влияют на транзиентную экспрессию GFP и общий уровень содержания белка в растительной ткани. Выводы. Результаты свидетельствуют, что тестируемые факторы не являются существенными для проведения Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии. Ключевые слова: Nicotiana excelsior, Agrobacterium, транзиентная экспрессия, GFP

Purification of recombinant GFP produced by Agrobacterum-mediated transient expression in Nicotiana excelsior

Green fluorescent protein (GFP) is commonly used as a reporter protein in a wide range of biological experiments. The efficient protocol of Agrobacterium mediated transient expression in Nicotiana excelsior was applied for quick preparative production of recombinant GFP. The protein purification scheme has been developed and included ammonium sulfate precipitation and Q sepharose anion exchange chromatography. It results in obtaining of a fraction with about 85 % GFP homogeneity and the protein yield of about 75 %.Зелений флуоресцентний білок (GFP) часто використовують як репортерний білок у різних галузях біологічних досліджень. Ефективний протокол Agrobacterium-опосередкованої транзієнтної експресії в Nicotiana excelsior було використано для швидкого одержання препаративної кількості рекомбінантного GFP. Розроблено схему очищення рекомбінантного білка, яка включає стадію осадження сульфатом амонію та іонообмінну хроматографію на сорбенті Q-sepharose. В результаті очищення було отримано фракцію білків з вмістом GFP близько 85 %. В ході очищення було отримано близько 75 % від початкової кількості рекомбінантного GFP.Зеленый флюоресцентный белок (GFP) часто используется в качестве маркерного белка в разных областях биологических исследований. Эффективный протокол Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии в Nicotiana excelsior был использован для быстрого получения препаративных количеств рекомбинантного GFP. Разработана схема очистки рекомбинантного белка, включающая стадию осаждения сульфатом аммония и ионообменную хроматографию на сорбенте Q-sepharose. В результате очистки была получена фракция белков с содержанием GFP около 85 %. В ходе очистки было выделено около 75 % от начального количества рекомбинантного GFP

Production of human interferon alfa 2b in plants of Nicotiana excelsior by Agrobacterium-mediated transient expression

Human interferon α2b gene was transiently expressed in Nicotiana excelsior plants. Fusion with N. plumbaginifolia calreticulin signal peptide for improved apoplast targeting and carrying out the expression under optimized conditions resulted in maximal interferon activity of 3.2 • 10³ IU/g fresh weight (FW) with an average of 2.1 ± 0.8 • 10³ IU/g FW. It proves that N. excelsior is a suitable host for Agrobacterium-mediated transient expression of genes encoding physiologically active human proteins. The transient expression conditions optimized for GFP marker protein were confirmed to be preferable for hIFN α2b.Ген интерферона α2b был транзиентно экспрессирован в растениях Nicotiana excelsior. Слияние целевого гена с последовательностью калретикулинового сигнального пептида из N. plumbaginifolia для улучшения транспорта продукта в апопласт и проведения транзиентной экспрессии в оптимальных условиях позволило добиться максимальной активности интерферона в листьях 3.2 • 10³ МЕ/г сырой массы при среднем значении 2.1 ± 0.8 • 10³ МЕ/г. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования N. excelsior для Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии фармацевтически активных белков человека. Показано, что условия транзиентной экспрессии, оптимизированные для получения репортерного белка GFP, подходят также для экспрессии гена интерферона α2b человека.Ген інтерферону α2b було транзієнтно експресовано у рослинах Nіcotіana excelsіor. Злиття цільового гена з послідовністю калретикулинового сигнального пептиду з N. plumbagіnіfolіa для поліпшення транспорту продукту в апопласт і проведення транзієнтної експресії в оптимальних умовах дозволило добитися максимальної активності інтерферону в листях 3.2 • 10³ МО/г сирої маси при середньому значенні 2.1 ± 0.8 • 10³ МО/г с.в. Отримані результати свідчать про можливість використання N. excelsіor для Agrobacterіum-опосередкованої транзієнтної експресії фармацевтично активних білків людини. Було показано, що умови транзієнтної експресії, оптимізовані для отримання репортерного білка GFP, підходять також для експресії гена інтерферону α2b людини

Transgenic plants regenerated from hairy roots of Nicotiana benthamiana: a promising host for transient expression of foreign proteins

Hairy root cultures of Nicotiana benthamiana have been obtained by co-cultivation of leaf explants with Agrobacterium rhizogenes strain A4 harboring a binary vector plasmid, and transgenic nature of the obtained cultures was confirmed by PCR analysis. Transgenic plants were regenerated from hairy roots. The biomass yield of transgenic plants grown in vitro was almost two-fold higher than those of wild-type N. benthamiana plants. They differed from untransformed plants by short internodes, reinforced stem, thick and wrinkled leaves and more developed root system. The level of Agrobacterium-mediated transient expression of green fluorescent protein (GFP) in the regenerated plants was similar to that of untransformed plants.Культуры корней «hairy roots» Nicotiana benthamiana были получены кокультивированием листовых эксплантов со штаммом Agrobacterium rhizogenes А4, содержащим бинарную векторную систему, и трансгенная природа полученных линий корней была доказана методом ПЦР. Из трансгенных корней были регенерированы растения. Биомасса регенерированных растений, культивировавшихся in vitro, превышала биомассу нетрансформированных растений N. benthamiana приблизительно в два раза. Они отличались от интактных растений укороченными междоузлиями, утолщенным стеблем, толстыми искривленными листьями и более развитой корневой системой. Уровень Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии репортерного белка GFP в регенерованных растениях не отличался от такового у нетрансформированных растений

Comparison of different systems for purification of recombinant proteins produced by transient expression in plants

Three different approaches for purification of transiently expressed recombinant proteins from plants using GFP as a reporter have been successfully applied. The purification scheme including ammonium sulfate precipitation and anion-exchange chromatography was compared with two tag-based protocols applying metal affinity chromatography with a 6xHis tag and intein mediated purification with a chitin-binding affinity tag.Три різних підходи для очищення рекомбінантних білків, отриманих методом транзієнтної експресії в рослинах, було успішно застосовано з використанням GFP як репортера. Схему очищення, яка включала преципітацію сульфатом амонію і аніонообмінну хроматографію, порівнювали з протоколами тегового очищення з використанням 6xHis-тега та хітин-інтеін-опосередкованого очищення.Три различных подхода для очистки рекомбинантных белков, полученных методом транзиентной экспрессии в растениях, были успешно применены с использованием GFP как репортера. Схему очистки, включающую преципитацию сульфатом аммония и анионообменную хроматографию, сравнивали с протоколами теговой очистки с использованием 6xHis-тега и хитин-интеин-опосредованной очистки

Obtaining and analysis of товассо, lettuce and rape plants transformed with human interferon alfa 2b gene

Plasmid constructs for Agrobacterium-mediated transformation of plant nuclear genome with human interferon alpha2b gene were built up and used to obtain transgenic plants of tobacco, lettuce and rape. Presence of the target gene was confirmed by PCR analysis and interferon activity in lettuce plants was shown by the vesicular stomatitis virus cytopathic effect assay.Сконструйовані вектори для Agrobacterium-опосередкованої трансформації ядерного геному рослин геном інтерферону альфа 2b людини були використані для отримання трансгенних рослин тютюну, салату та ріпаку. Присутність цільового гену було показано за допомогою ПЛР аналізу. Трансформовані рослини салату демонстрували антивірусну активність інтерферону.Сконструированные вектора для Agrobacterium-опосредованной трансформации ядерного генома растений геном интерферона альфа 2b человека были использованы для получения трансгенных растений табака, салата и рапса. Присутствие целевого гена было показано с помощью ПЦР анализа. Трансформированные растения салата демонстрировали антивирусную активность интерферона

Creation of transgenic Brassica napus L. Plants expressing human alpha 2b interferon gene

Spring rapeseed transgenic lines expressing human interferon alpha 2b were created by Agrobacteriummediated transformation of aseptic plant leaf explants. The maximum antiviral activity of the leaf extracts reached 4500 IU/g fresh weight. It was determined that the antioxidant activity and the activity of an enzyme of plant antioxidant system – superoxide dismutase (SOD) – in the leaf tissues of transgenic plants increased compared to controls. There were no correlations between the interferon and antioxidant activities, as well as between SOD and interferon activities. Using the obtained transgenic rapeseed plants with high interferon and antioxidant activities as a feed additive for animals might have preventive effect on their body, increasing resistance to infections of various origins.Методом агробактериальной трансформации листовых эксплантов асептических растений ярового рапса получены линии, экспрессирующие альфа 2b интерферон человека. Максимальная противо-вирусная активность экстрактов листьев достигала 4500 МЕ/сырого веса. Установлено, что антиоксидантная активность и активность одного из ферментов антиоксидантной системы растений – супероксиддисмутазы (СОД) – в тканях листьев трансгенных растений повышена по сравнению с контрольными. Не выявлено корреляции как между активностью интерферона и антиоксидантной активностью, так и между активностью интерферона и активностью СОД. Использование полученных трансгенных растений рапса с высокой активностью интерферона и повышенной антиоксидантной активностью как добавки к кормам животных могло бы оказывать профилактическое влияние на их организм, повышая устойчивость к различным инфекциям.Методом агробактеріальної трансформації листових експлантів асептичних рослин ярого ріпака отримано лінії, що експресують альфа 2b інтерферон людини. Максимальна противірусна активність екстрактів листків сягала 4500 МО/сирої ваги. Встановлено, що антиоксидантна активність і активність одного з ферментів антиоксидантної системи рослин – супероксиддисмутази (СОД) – в тканинах листків трансгенних рослин підвищена в порівнянні з контрольними. Не виявлено кореляції ні між активністю інтерферона і антиоксидантною активністю, ні між активністю інтерферона і активністю СОД. Використання отриманих трансгенних рослин ріпака з високою активністю інтерферона та підвищеною антиоксидантною активністю як добавки до кормів тварин мало б профілактично впливати на їхній організм, підвищуючи стійкість до інфекцій різного походження

Multiplex PCR assay for detection of human interferon alpha2b gene in transgenic plants

During the last decade interferons are regarded as potent candidates for generation of plant-based edible vaccines because of broad spectrum of antiviral activities and adjuvant properties. Establishment and certification of numerous interferon producing plant systems requests development of fast and efficient multiplex PCR protocol for the transgene detection in GM plants. Here we represent a protocol for simultaneous amplification in one assay of fragments of hIFN alpha 2b gene and two control genes, namely virD1 of Agrobacterium tumefaciens and conservative region of plant actin gene.В последнее десятилетие интерфероны рассматриваются как перспективные кандидаты для получения из растений в виде съедобных вакцин, поскольку обладают широким спектром антивирусной активности и адъювантными свойствами. Создание и сертификация многочисленных растительных систем, продуцирующих рекомбинантный интерферон, делают актуальной разработку быстрого и эффективного протокола мультиплексной ПЦР для определения данного трансгена в генетически модифицированных растениях. В настоящей публикации мы приводим метод детекции гена человеческого интерферона альфа-2b в трансгенных растениях с помощью совместной амплификации в ходе одной реакции фрагментов гена hINTα2b и двух контрольных генов, virD1 Agrobacterium tumefaciens и консервативного участка гена актина растений.В останнє десятиліття інтерферони розглядаються як перспективні кандидати для отримання з рослин у вигляді їстівних вакцин оскільки, вони мають широкий спектр антивірусної активності й ад’ювантні властивості. Створення і сертифікація численних рослинних систем, які накопичують рекомбінантний інтерферон, роблять актуальною розробку швидкого й ефективного протоколу мультиплексної ПЛР для визначення даного трансгена в генетично модифікованих рослинах. В цій публікації ми наводимо метод детекції гена людського інтерферону альфа-2b у трансгенних рослинах за допомогою сумісної ампліфікації в ході однієї реакції фрагментів гена hINTα2b і двох контрольних генів, virD1 Agrobacterium tumefaciens і консервативної ділянки гена актину рослин