Obtaining and Characterization of Hybridomas Producing Monoclonal Antibodies against Coronavirus SARS-CоV-2

The aim of the work was to obtain and characterize hybridomas producing monoclonal antibodies to antigens of coronavirus SARS‑CoV‑2, promising for the construction of diagnostic immunochemical tests. Materials and methods. Recombinant nucleocapsid and receptor binding fragment of spike protein of SARS‑CoV‑2 were used for immunization of BALB/c mice. Antigens were absorbed on aluminium hydroxide gel and injected subcutaneously to BALB/c mice at a 7-day-interval. Immune splenocytes and myeloma cells SP2/0-Ag14 were fused by polyethylene glycol 1450. Cell cultures producing specific antibodies against nucleocapsid and receptor binding fragment were selected applying indirect ELISA in 96-well plates sensitized by desired antigens. Clones of hybridomas were obtained using the method of limiting dilutions. Production properties were studied through in vitro cultivation in 24-well culture plates. Immune-ascitic fluids were collected during the cultivation of hybrid cells in peritoneal cavities of BALB/c mice. Monoclonal antibodies were purified by affinity chromatography on protein A sepharose sorbent, conjugated with horseradish peroxidase, and tested for the possibility to be used in sandwich ELISA for detection of inactivated SARS‑CoV‑2 coronavirus strain “Isolate B”. Results and discussion. As a result of hybridization and selection of clones, hybridomas producing monoclonal antibodies to nucleocapsid and receptor binding fragment of SARS‑CoV‑2 have been obtained. During the in vitro and in vivo cultivation the clones maintained the consistent proliferative and antibody producing activity. The application of monoclonal antibody 415D12 as a capture one and 411D12 antibody conjugated with horseradish peroxidase as a detector antibody in ELISA allows for identifying SARS‑CoV‑2 coronavirus at a minimum concentration of 1·103 PFU per ml

МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА БЕЛЫХ МЫШЕЙ И МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АНТИБИОТИКО- АССОЦИИРОВАННОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕЕ КОРРЕКЦИИ ПРЕБИОТИКОМ СТИМБИФИД

Analysis of the composition of intestinal microflora of white mice and guinea pigs in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis and assessment of the possibility of its correction with prebiotic Stimbifid. White mice and guinea pigs in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis were used in the experiments. The recovery of their own intestinal microflora of laboratory animals was evaluated after prebiotic Stimbifid oral administration. The positive effect of prebiotic Stimbifid has been found to restore their own intestinal microflora of white mice and guinea pigs, including Bifidobacteria, Lactobacillus and Escherichia. Prebiotic Stimbifid has been shown to be useful for the correction of the intestinal microflora of laboratory animals in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis.Изучен состав микрофлоры кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и оценка возможности ее коррекции пребиотиком Стимбифид. В экспериментах использовали белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Оценивали восстановление собственной микрофлоры кишечника лабораторных животных при пероральном введении пребиотика Стимбифид. Установлено положительное влияние пребиотика Стимбифид на восстановление собственной кишечной микрофлоры белых мышей и морских свинок, в том числе бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Пребиотик Стимбифид является эффективным средством коррекции нарушений микрофлоры кишечника у лабораторных животных с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом

ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И КОРРЕКЦИИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗЕ

The possibility was studied of preventing the development of pseudotuberculosis and correcting the dysbiotic disorders of the intestinal microflora in conventional white mice with prebiotic «Stimbifid» and exometabolites in supernatant fluids of native cultures of probiotic bifidobacteria and lactobacilli, which have prebiotic effect. Conventional white mice were infected orally with pseudotuberculosis microbe culture and the development of infection was evaluated. Prebiotic «Stimbifid» and supernatant fluid of lactobacilli native culture, administered to animals orally, as injected intramuscular gentamicin, completely stopped the infection development. In contrast to the antibiotic gentamicin prebiotic «Stimbifid» and supernatant fluid of lactobacilli native culture, administered orally, prevented the development of the intestinal dysbiosis in animals.Изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей пребиотиком «Стимбифид» и экзометаболитами надосадочной жидкости нативных культур пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, обладающих пребиотическим действием. Конвенциональных белых мышей инфицировали перорально культурой псевдотуберкулезного микроба и оценивали развитие инфекционного процесса. Пребиотик «Стимбифид» и надосадочная жидкость нативной культуры лактобактерий, введенные животным перорально, как и введенный внутримышечно гентамицин, полностью купировали развитие инфекционного процесса. В отличие от антибиотика гентамицина, пребиотик «Стимбифид» и надосадочная жидкость нативной культуры лактобактерий, введенные перорально, предотвратили развитие дисбактериоза кишечника у животных

ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Development of methodology for the identification of certified probiotic microorganisms in the intestinal contents of white mice and uinea pigs and study of their survival in the gastrointestinal tract of experimental animals. Rifampicin-resistant bifidobacteria and lactobacilli were used in the experiments. Cultures of microorganisms that have retained the species features were administered orally for 14 days and the number of viable bifidobacteria and lactobacilli were determined by sowing of feces in a dense nutrient medium with rifampicin. Probiotic microorganisms administered orally to experimental animals for 14 days are detected in the feces on the second day of the experiment. Live probiotic bacteria ceases completely to be detected in the feces of animals 3 days after the termination of their oral administration. Using the developed universal method of differentiation of probiotic microorganisms entering the living organisms and strains of their own intestinal microflora a significant decrease (4–7 orders of magnitude) in survival of bifidobacteria and lactobacilli in the organisms of experimental animals was shown, followed by a lack of probiotic effect.Разработана методика выявления в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок сертифицированных пробиотических микроорганизмов и изучена их выживаемость в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. В экспериментах использовали устойчивые к рифампицину бифидобактерии и лактобактерии. Культуры микроорганизмов, сохранивших видовые признаки, вводили перорально в течение 14 суток и определяли число жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий путем высева фекалий на плотную питательную среду с рифампицином. Пробиотические микроорганизмы, вводимые перорально экспериментальным животным в течение 14 суток, обнаруживаются в фекалиях на 2-е сутки эксперимента. Живые пробиотические микроорганизмы полностью перестают обнаруживаться в фекалиях животных через 3 суток после окончания их перорального введения. С использованием разработанной универсальной методики дифференциации поступающих в живой организм пробиотических микроорганизмов и штаммов собственной кишечной микрофлоры показано существенное – на 4–7 порядков снижение выживших в организме экспериментальных животных бифидобактерий и лактобактерий, сопровождающееся отсутствием пробиотического эффекта

ЛИМФОЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АУТОШТАММОВ ГОМОПРОБИОТИЧЕСКИХ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ

The results of the experimental studies of the lymphocytotoxic effect of homoprobiotic bidfidobacteria and lactobacilli autostrains on lymphocytes of guinea pigs are presented. Autostrains of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli isolated from the feces of guinea pigs were used in the experiments. Isolation of the fraction of lymphocytes from the blood of guinea pigs for lymphocytotoxic test was carried out according to the sanitary rules SP 3.3.2.561-96. Intensity of damage in lymphocytes was assessed by counting the points and the cytotoxic index. The experimental results indicate that under the influence of large doses of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli autostrains cytolysis occurs of only a small number of lymphocytes, and thus, the reaction of lymphocytes with autostrains of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli is within the physiological range.Представлены результаты экспериментального изучения лимфоцитотоксического действия аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий на лимфоциты крови морских свинок. В экспериментах использовали аутоштаммы гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из фекалий подопытных морских свинок. Выделение фракций лимфоцитов из крови морских свинок для постановки лимфоцитотоксического теста проводили согласно санитарным правилам СП 3.3.2.561-96. Выраженность повреждения лимфоцитов оценивали в баллах и путем подсчета цитотоксического индекса. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что под воздействием больших доз аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий происходит цитолиз лишь небольшого количества лимфоцитов и, таким образом, реакция лимфоцитов с аутоштаммами гомопробиотических микроорганизмов не выходит за пределы физиологической нормы

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ

The results are presented of evaluation of the efficiency of the filtered aqueous suspension of white mice (donors) feces and microorganisms of indigenous microflora in the correction of intestinal microbiocenosis of conventional white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis with administration of suspension and microorganisms per os and per rectum. After the start of administration of suspension and microorganisms of fecal microflora to experimental animals the dynamics of the total content of microorganisms and the number of some representatives of intestinal microflora in 1 g of feces were evaluated in comparison with self-recovery of intestinal microflora in the control group animals. Results showed that the supernatant of an aqueous suspension of white mice (donors) feces, containing microbial exometabolites and other biologically active compounds, has in a short time the most pronounced effect on the recovery of the normal intestinal microflora in experimental animals.Приведены результаты изучения эффективности отфильтрованной водной суспензии фекалий белых мышей-доноров и микроорганизмов их индигенной микрофлоры в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом при введении суспензии и микроорганизмов реr оs и реr rесtum. После начала введения надосадочной жидкости суспензии и микроорганизмов фекальной микрофлоры у подопытных животных оценивали динамику общего содержания микроорганизмов в 1 г фекалий и отдельных представителей кишечной микрофлоры в сравнении с самовосстановлением кишечной микрофлоры у животных контрольной группы. Установлено, что надосадочная жидкость водной суспензии фекалий белых мышей-доноров, содержащая микробные экзометаболиты и другие биологически активные соединения, оказывает в короткие сроки наиболее выраженное влияние на восстановление нормальной кишечной микрофлоры у подопытных животных

АНАЛИЗ ДИНАМИКИ ЗАРАЖЕННОСТИ КЛЕЩЕЙ БАБЕЗИЯМИ НА ТЕРРИТОРИИ КИРОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Objective of research: To study the spread of causative agents of babesiosis in ticks collected on the territory of the Kirov region with the use of molecular-genetic methods. Materials and methods: In this paper, the method of molecular-genetic detection of genetic material of the pathogen in the sample was used (the method of polymerase chain reaction (PCR). Ticks were collected from vegetation cover as well as from people and domestic animals (dogs, cats). Ticks were estimated according to identification tables. Causative agents of babesiosis were determined by the extraction of total nucleic acids from each tick; all ticks were examined using PCR. Total DNA extraction from ticks stored in 70% ethyl alcohol was performed with the use of guanidine thiocyanate. The proportion of ticks infected with Babesia was determined depending on the year, collection area on the territory of the Kirov region, species and sexual belonging of ticks. Results and discussion: It was found that the major tick vectors of Babesia on the territory of the Kirov region are ticks Ixodes persulcatus . In addition, two other tick species Dermacentor reticulatus and I. ricinus were detected in that region. It was shown, that the rate of Babesia infection in ticks Ixodes persulcatus was higher than in D. reticulatus and I. ricinus . The average percentage of ticks infected with Babesia was 53,07 %. A gradual increase of percentage of infected individuals with the maximum value 73,2 % was registered in 2012. However, in the following year, a significant decrease (51,7 %) was reported, and the minimum number of ticks infected with Babesia was observed in 2014 (37,4 %). A significant increase in infestation of ticks was newly observed in 2015 (50,4 %). It was found that male and female ticks are equally likely to be vectors for Babesia. Infection rates in male and female ticks were 54,5 and 49,3 %, respectively. Fluctuations in the number of infected ticks depending on the year (maximum in 2012 and minimum in 2014) were determined. Ticks from South-West districts of the region are mostly infected with Babesia. In the city of Kirov, 55,8 % of ticks are infected with Babesia in spite of acaricide treatment.Цель работы - изучить распространение возбудителей бабезиоза у клещей на территории Кировской области. Материалы и методы. Сбор клещей проводили с растительного покрова, а также с людей и домашних животных (собак, кошек). Клещей идентифицировали по определительным таблицам. Наличие возбудителей бабезиоза определяли при исследовании суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из каждого клеща, с последующей постановкой ПЦР. Суммарную ДНК экстрагировали с помощью гуанидинтиоизоцианатного метода из клещей, фиксированных в 70%-ном этиловом спирте. Определяли процент зараженных бабезиями клещей в зависимости от года, района сбора на территории Кировской области, видовой и половой принадлежности. Результаты и обсуждение. Установлено, что основным видом клещей - переносчиков бабезиоза на территории области является Ixodes persulcatus . Также были обнаружены клещи Dermacentor reticulatus и I. ricinus . Показано, что зараженность клещей I. persulcatus оказалась выше, чем D. reticulatus и I. ricinus . Средняя доля клещей, зараженных бабезиями, составила 53,07 %. Установлено постепенное повышение процента зараженных особей с максимумом в 2012 г. (73,2 %). Однако, уже в следующем году отмечен значительный спад (51,7 %), а минимальное число зараженных клещей наблюдали в 2014 г. - 37,4 %. В 2015 г. вновь отмечали значительный рост зараженности клещей (50,4 %). Самцы и самки в равной степени могут быть переносчиками бабезий. Зараженность самок и самцов бабезиями составила соответственно 54,5 и 49,3 %. Установлены колебания численности зараженных клещей в зависимости от года (максимум - в 2012 г. и минимум - в 2014 г.). Клещи юго-восточных районов области заражены бабезиями в наибольшей степени. На территории города Кирова клещи на 55,8 % заражены бабезиями, несмотря на акарицидные обработки

Development of the Immuno-Enzyme Test-System for the Detection of <i>Legionella pheumophila</i>, Serogroup I

Developed is the highly sensitive and specific immuno-enzyme test-system, which is perspective for the detection of L. pneumophilia, serogroup 1. Isolated are the three hybrid cell lines that secrete monoclonal antibodies to specific epitopes of L. pneumophilia, serogroup 1 lipopolysaccharide antigen. Hyper immune rabbit sera, characterized by highly specific activity and specificity, are obtained using lipopolysaccharide antigen

ДИСБИОЗ КИШЕЧНИКА, ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ

The interest of scientists, physicians, pediatricians, general practitioners to the problem of intestinal dysbiosis is caused by the fact that there are very close relations between the intestinal microbiocenosis disorders and organic and functional pathology not only of the gastrointestinal tract, but also of other organs. For more than 50 years probiotics have been the leading tool for correction of intestinal microbiocenosis. However, the response of intestinal microbiota to exogenous intake of probiotics is variable, or is completely absent. The article presents the analysis of the literature data and results of our own experimental studies on human volunteers, fully confirming previous findings on laboratory animals, according to which the probiotic microorganisms are foreign and do not survive in the gastrointestinal tract of humans and animals, and their interaction with the host organism has the character of «host against probiotic». The results of the comparative study on the effectiveness of 18 modern preparations for correction of intestinal microbiocenosis at antibiotic-associated dysbiosis in experiments on animals are given. The comparative experimental research on the effectiveness of modern preparations that are frequently used in clinical practice as well as recent innovative commercial and experimental preparations (Actoflor-C. Stimbifid plus, Stimex) regarding intestinal microbiota recovery at antibioticassociated dysbiosis in conventional white mice was carried out.Интерес научных работников, терапевтов, педиатров, врачей общего профиля к проблеме дисбиоза кишечника обусловлен тем, что существуют самые тесные связи между нарушением микробиоценоза кишечника и органической, а также функциональной патологией не только желудочно-кишечного тракта, но и других органов. На протяжении свыше 50 лет пробиотики являлись ведущим средством коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника. Однако ответ кишечной микробиоты на экзогенное поступление в организм пробиотиков вариабелен или вовсе отсутствует. В настоящей статье представлены анализ литературных данных и результаты собственных экспериментальных исследований на добровольцах, полностью подтверждающие полученные ранее данные на лабораторных животных, согласно которым, пробиотические микроорганизмы являются чужеродными и не приживаются в желудочно-кишечном тракте людей и животных, а их взаимодействие с организмом носит характер «хозяин против пробиотика». Приведены результаты сравнительного изучения в опытах на животных эффективности 18 современных средств коррекции нарушений микробиоценоза кишечника при антибиотико-ассоциированном дисбиозе кишечника. Проведено сравнительное экспериментальное изучение эффективности восстановления кишечной микробиоты современных, часто применяемых в клинической практике препаратов, а также инновационных коммерческих и экспериментальных препаратов последнего времени (Актофлор-С, Стимбифид плюс, Стимекс)при антибиотико-ассоциированном дисбиозе у конвенциональных белых мышей

АУТОПРОБИОТИКОТЕРАПИЯ

The results are presented of the experimental study of survival rates of autologous bifidobacteria and lactobacilli strains (autostrains) in the intestines of conventional white mice and guinea pigs, as well as an assessment of the effectiveness of the use of isolated bifidobacteria and lactobacilli autostrains in the correction of microecological disorders in the intestines of animals with antibiotic-associated dysbacteriosis. Bifidobacteria and lactobacilli autostrains isolated from intestinal contents of conventional white mice and guinea pigs, as well as rifampicin-resistant derivatives of isolated bacterial autostrains were used in the experiments. It is found that rifampicin-resistant derivatives of bifidobacteria and lactobacilli autostrains retain species and genetically fixed sign of antibiotic resistance. Administered orally to experimental animals, autostrains of bifidobacteria and lactobacilli do not survive in the intestines of animals and are eliminated to 4 days after cessation of administration. Bifidobacteria and lactobacilli autostrains exert virtually no influence on the recovery of the intestinal microbiota in experimental animals with antibiotic-associated dysbacteriosis unlike lactobacilli metabolites and prebiotic Stimbifid, efficiently restoring intestinal microbiota in a short timeПредставлены результаты экспериментального изучения выживаемости и приживаемости аутологичных штаммов (аутоштаммов) бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике конвенциональных белых мышей и морских свинок, а также результаты оценки эффективности использования выделенных аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий при коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике животных с антибиотико-ассоциированном дисбактериозом. В экспериментах использовали аутоштаммы бифидобактерий и лактобактерий, выделенные из кишечного содержимого конвенциональных белых мышей и морских свинок, а также рифампициноустойчивые производные выделенных бактериальных аутоштаммов. Установлено, что рифампициноустойчивые производные аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий сохраняют видовую принадлежность и наследственно закрепленный признак антибиотикорезистентности. Введенные перорально подопытным животным аутоштаммы бифидобактерий и лактобактерий не приживаются в кишечнике и элиминируются к 4-м суткам после прекращения введения. Аутоштаммы бифидобактерий и лактобактерий практически не оказывают влияние на восстановление кишечной микробиоты у подопытных животных с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, в отличие от метаболитов лактобактерий и пребиотика Стимбифид, эффективно восстанавливающих кишечную микробиоту в сжатые сроки