Trauma induces apoptosis in human thoracolumbar intervertebral discs

BACKGROUND: Vertebral fractures resulting from high energy trauma often comprise the risk of posttraumatic degenerative changes in the affected intervertebral discs (IVD). Particularly in conservatively treated patients, or in cases after implant removal of an exclusively posterior stabilization, consecutive disc degeneration and the associated functional losing of the spinal segment clearly represent detrimental treatment results. In this regard, apoptosis of IVD cells has been suggested to be involved in the critical changes of the extracellular matrix. METHODS: To investigate whether fractures of the vertebrae induce apoptosis in the affected IVD, disc tissue from patients (n = 17) undergoing open reduction and internal fixation of thoracolumbar spine fractures were analysed in regards to caspase activity, apoptosis-receptor expression levels and gene expression of apoptosis-regulating proteins such as Bax and Bcl-2. Healthy IVD tissue (n = 3) obtained from patients undergoing surgical resection of adjacent vertebrae were used as control samples. RESULTS: In contrast to healthy control IVD tissues, samples from traumatic thoracolumbar IVD showed positive TUNEL staining and a significant increase of caspase-3/7 activity. Interestingly, analyses of the initiator caspase-8 and -9 revealed significantly increased activation levels compared to control values, suggesting the coexistent activation of both the extrinsic (receptor-mediated) and intrinsic (mitochondria-mediated) apoptosis pathway. Accordingly, expression levels of the Fas receptor (FasR) mRNA were significantly increased. Although the TNF receptor I (TNFR I) was only slightly upregulated, corresponding TNFα from trauma IVD presented significantly increased mRNA expression values. Furthermore, traumatic IVD cells demonstrated significantly reduced expression of the mitochondria-bound anti-apoptotic Bcl-2, thereby maintaining baseline transcriptional levels of the pro-apoptotic Bax protein when compared to control IVD cells. CONCLUSION: Our data suggest that thoracolumbar fractures induce early caspase-dependent apoptosis in IVD cells of the affected intervertebral disc, in part, by downregulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 (intrinsic apoptosis pathway), as well as signalling via the death receptor complex (TNFR I and FasR)

Ro/SSA52 autoantigen, associated with SLE, shows an enhanced mRNA and protein expression in human keratinocyte by TNF-stimulation

Der systemische Lupus erythematodes ist eine klassische Autoimmunerkrankung, die unterschiedliche Organe betrifft und durch das Vorkommen einer Vielzahl von Autoantikörpern, die u.a. gegen nukleäre und zytoplasmatische Autoantigene gerichtet sind, gekennzeichnet ist. Autoantikörper gegen das nukleäre Ribonukleoprotein Ro/SSA sind überdurchschnittlich häufig mit photosensitiven Hauterscheinungen assoziiert und werden in 50% der Seren von Patienten mit SLE sowie in mehr als 80% der Seren von Patienten mit Sjögren-Syndrom, subakut kutanem Lupus sowie neonatalem Lupus detektiert. Die dabei entstehenden Ro /SSA-Immunkomplexe lassen sich insbesondere in der Epidermis von SLE-Patienten nachweisen 104,105. Zytokine wie TNF- sind an der Membranexpression des intrazellulären Ro/SSA52-Proteins in humanen Keratinozyten beteiligt 30,106. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Ro/SSA52 -mRNA-Expression in humanen Keratinozyten etabliert. Durch die Realtime-PCR können mittels relativer Quantifizierung und interner Kontrolle durch GAPDH hochsensitiv Ro/SSA52-mRNA-Produkte detektiert werden. Das Maximum der Ro/SSA52-mRNA-Expression wird in primären Keratinozyten wie auch in der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT nach 4h erreicht. Die Keratinozyten verschiedener gesunder Personen sind hierbei unterschiedlich empfindlich auf die Behandlung mit dem Zytokin. In der HaCaT-Zelllinie lässt sich eine deutlich höhere Ro/SSA52-mRNA-Expression als in primären Zellen beobachten. Die Induktion der Ro/SSA52-mRNA-Expression wird über den TNF-Rezeptor I vermittelt, während der TNF-Rezeptor II die über den TNF-Rezeptor I hervorgerufene Expressionserhöhung von Ro/SSA52-mRNA unterdrückt. TNF- induziert die Freisetzung von sekundären proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 und IL-8 sowie die des antiinflammatorischen Zytokins IL-10. Darüber hinaus fördert TNF- in primären Keratinozyten nach 24h Stimulation seine eigene vermehrte Freisetzung und ist 100-fach erhöht nachweisbar. IL-6 und IL-8 weisen eine maximale Freisetzung schon nach 4h auf und sind siebenfach bzw. 20-fach erhöht detektierbar. Die Realtime-PCR ist eine sehr sensitive Methode zur Bestimmung der mRNA-Expression des Ro/SA52-Autoantigens in Keratinozyten, die anderen bislang verwendeten Methoden wie der konventionelle PCR oder dem Northern-Blot überlegen ist. Die Effekte von TNF- auf die Induktion von Ro/SSA52-mRNA zusammen mit schon publizierten Daten zur Ro/SSA52-Proteinexpression 30,127 deutet auf eine bedeutende Rolle von TNF- bei Anti-Ro/SSA-assoziierten, inflammatorischen Hautmanifestationen bei Patienten mit Lupus erythematodes hin. Der wesentliche pathophysiologische Einfluss des Zytokins lässt den therapeutischen Einsatz von TNF--Blockern bei photosensitiven, Anti-Ro/SSA-assoziierten kutanen Formen des Lupus erythematodes vielversprechend erscheinen.Anti-nuclear antibody response is a frequent feature among a number of systemic autoimmune diseases such as SLE or Sjögrens-Syndrome (SS). The immune response in patients with rheumatic autoimmune diseases is remarkably focussed on a particular group of nuclear self-antigens, including U1-RNP, Sm and Ro/SSA. Reasons to explain why nucleoprotein complexes are most prominent detected by autoantibodies remain unclear and are addressed to some extent by their intracellular localization, high charge and immune-stimulatory capacity of RNAs. Moreover, the immunogenicity was interpreted by the release of dominant self-antigens from dying cells and accumulation on the surface of apoptotic blebs, which led to an enhanced binding of autoantibodies. Commonly used cells which have been chosen to explore Ro/SSA autoantibody binding are skin keratinocytes. They vastly are detectable in the epidermal skin compartment and are constantly in touch with external stimuli providing comprehensive innate immune mechanisms. Anti-Ro/SSA autoantibodies, produced in photosensitive LE may contribute directly in the pathogenesis, elucidated by promotion of cell death in different target organs and by their deposition in peripheral skin. Approximately 70% of the initial cohort of patients with cutaneous Lupus (SCLE) either displayed abnormal amounts of anti-nuclear antibodies (ANA) as well as anti-Ro/SSA-antibodies. The frequency of other autoantibodies usually found in SLE patients such as double-stranded DNA and Sm were seen far below to anti-Ro/SSA autoantibodies found in SCLE patients. The deposition of IgG`s is apparently a common event in the skin of patients with systemic or cutaneous lupus erythematosus. In about 90% of chronically skin lesions and in about 60% of acute skin lesions immunoglobulins permanently have been deposited. With regard to the complex nature of the Ro/SSA autoantigen and its ubiquitous expression in mammalians, makes it challenging to investigate how either the entire Ro/SSA autoantigen complex or its merely protein components are exposed to autoantibodies. Concerning the work of Dörner et al., inflammatory cytokines such as TNF- were identified to induce the protein expression of Ro/SSA on primary human keratinocytes. In the past decade the knowledge about mechanisms underlying reinforced accumulation of the Ro/SSA autoantigen on apoptotic cells had been significantly improved [13, 35, 36], while its mRNA and protein expression on viable cells in most instances remained unsettled. By using highly sensitive real time PCR, TNF--induced mRNA expression of Ro/SSA52 in non-apoptotic primary keratinocytes and in keratinocyte cell line HaCaT was investigated. Ro/SSA52 mRNA expression peaked at 4h and is up-regulated by TNF-RI and inhibited by TNF-RII. The TNF--induced enhanced mRNA expression resulted in an elevated Ro/SSA52 protein expression after 24h. Although a small number of viable cells relocate Ro/SSA52 mRNA on the cell surface, the activated, anti-Ro/SSA52 antibody-mediated cytotoxicity (ADCC) provided the evidence of the Ro/SSA52 protein functionality. We conclude that irrespective of induction of apoptosis, Ro/SSA52 keratinocyte expression on viable cells may contribute to the development of autoantibody-mediated photosensitive skin manifestations as well as to the induction or maintenance of autoimmune responses

Heteropterys macrostachya

Angiosperm

Development of a Ribozyme an DNAzyme mediated therapeutical strategy against allergy and asthma

GesamtdissertationDie komplexe Pathogenese allergischer Erkrankungen und des Asthma bronchiale macht die Entwicklung neuer Therapieansätze notwendig. Von grundlegender pathophysiologischer Bedeutung für die Entstehung allergischer Erkrankungen sind die Zytokine IL-4 und IL-13. In der IL-4- und IL-13-vermittelten Signaltransduktion nimmt der Transkriptionsfaktor STAT6 eine zentrale Stellung ein. Untersuchungen an stat6-knockout-Mäusen zeigen, daß stat6 für die Ausprägung des allergischen Phänotypes wesentlich ist. Mit der Anwendung von Ribozymen und DNAzymen wird eine therapeutische Strategie auf Nukleinsäure- Basis zur spezifischen Spaltung der mRNA des Transkriptionsfaktors stat6 der Maus verfolgt. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten mstat6-spezifischen Ribozyme besitzen eine GUC-Konsensussequenz und 6 nt lange Bindungsarme. Potentielle Ribozym-Spaltstellen werden auf der Grundlage von Sekundärstrukturberechnungen der mstat6-RNA identifiziert und liegen in einzelsträngigen Loop-Strukturen. Für eine stabile Expression werden die für die Ribozyme kodierenden Oligonuleotide in die Expressionskassette pGvaL kloniert. Insgesamt finden drei mstat6-spezifische Ribozyme Verwendung, deren Aktivität unter zellfreien Bedingungen getestet wird. Alle drei untersuchten Ribozyme sind in-vitro nicht aktiv. Unter Verwendung eines Multiplex- Aktivitäts-Assays wird auf der RNA des stat6 der Maus ein Screening nach zugänglichen DNAzym-Spaltstellen vorgenommen. Die dafür eingesetzten DNAzyme haben eine RU-Konsensussequenz (R = A, G) und besitzen Bindungsarme mit einer Länge von jeweils 9 nt. Für die Lokalisation der Bindungsstellen ist die thermodynamische Stabilität ∆G0 der DNAzym-Substrat-Heteroduplex entscheidend. Die reziproke Korrelation von DNAzym-Aktivität und ∆G0 führt zur Auswahl von 41 DNAzym-Spaltstellen mit einem ∆G0 von jeweils ≤ \- 25 kcal/mol im Sequenzbereich von 150 - 600 bp sowie von 1,7 - 2 kb. Für die Auswahl des Sequenzbereiches 1,7 - 2 kb ist die Beschreibung von humanen stat6-Spleißvarianten von Bedeutung, da diese auf einer Deletion im Sequenzbereich von 1765 - 1863 bp beruhen. Von den 41 im Multiplex-Aktivitäts- Assay getesteten DNAzymen weisen acht DNAzyme eine Spaltungsaktivität auf. Die Testung aller acht DNAzyme in einem zellfreien System ergibt, daß sie über einen Zeitraum von 60 min aktiv sind. In weiterführenden Experimenten wird zu prüfen sein, ob die unter zellfreien Bedingungen aktiven DNAzyme auch in Zellkulturen sowie allergischen Mausmodellen wirksam sind.The highly complex pathogenesis of allergic diseases such as asthma requires the development of new and specific therapeutical approaches. Both Interleukine-4 and Interleukine-13, respectively, are attributed to play an essential role in the development of allergic asthma via activation of the signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6). Investigation of stat6-deficient allergic mice demonstrated that stat6 is critical involved in the allergic phenotype. By the application of ribozymes and DNAzymes a nucleic acid based therapeutical strategy was choosen to investigate whether murine stat6 mRNA could be specifically cleaved in-vitro. Murine stat6-specific ribozymes adopted a GUC consensus sequence with binding arms of both 6 nt and were developed on the basis of computational secondary structure calculation of the murine stat6 transcript. For stable ribozyme expression a recently described pGvaL expression cassette was used. However; all tested ribozymes did not show any in-vitro activity. With the use of a multiplex activity assay the murine stat6 transcript was screened for DNAzyme cleavage sites. The converse correlation between the thermodynamic stability of the DNAzyme- substrate heteroduplex and an improved DNAzyme activity revealed potential cleavage sites on the murine stat6 transcript. Within 41 DNAzymes tested in the multiplex assay eight DNAzymes showed distinct cleavage activities on the transcript. Subsequently, the results were strongly confirmed in a cell-free system. The used DNAzymes had RU consensus sequences with R = A, G and binding arms of 9 nt. Additional in-vitro analyses provide evidence that these stat6-specific DNAzymes were active over a time period of 60 minutes. Further experiments have to test the murine stat6-specific DNAzymes in cell based systems and appropriate allergic mice models

Vom Expertenentscheid zum Risikodialog

Die Umsetzung nachhaltiger Hochwasserschutzprojekte ist ein äusserst komplexer Prozess. Er erfordert eine detaillierte Analyse des Projektkontexts und den Einbezug aller Akteure. Als Entscheidungshilfe dient das im Rhone-Thur-Projekt erarbeitete Handbuch «Wasserbauprojekte gemeinsam planen»