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Trauma induces apoptosis in human thoracolumbar intervertebral discs
BACKGROUND: Vertebral fractures resulting from high energy trauma often comprise the risk of posttraumatic degenerative changes in the affected intervertebral discs (IVD). Particularly in conservatively treated patients, or in cases after implant removal of an exclusively posterior stabilization, consecutive disc degeneration and the associated functional losing of the spinal segment clearly represent detrimental treatment results. In this regard, apoptosis of IVD cells has been suggested to be involved in the critical changes of the extracellular matrix. METHODS: To investigate whether fractures of the vertebrae induce apoptosis in the affected IVD, disc tissue from patients (n = 17) undergoing open reduction and internal fixation of thoracolumbar spine fractures were analysed in regards to caspase activity, apoptosis-receptor expression levels and gene expression of apoptosis-regulating proteins such as Bax and Bcl-2. Healthy IVD tissue (n = 3) obtained from patients undergoing surgical resection of adjacent vertebrae were used as control samples. RESULTS: In contrast to healthy control IVD tissues, samples from traumatic thoracolumbar IVD showed positive TUNEL staining and a significant increase of caspase-3/7 activity. Interestingly, analyses of the initiator caspase-8 and -9 revealed significantly increased activation levels compared to control values, suggesting the coexistent activation of both the extrinsic (receptor-mediated) and intrinsic (mitochondria-mediated) apoptosis pathway. Accordingly, expression levels of the Fas receptor (FasR) mRNA were significantly increased. Although the TNF receptor I (TNFR I) was only slightly upregulated, corresponding TNFα from trauma IVD presented significantly increased mRNA expression values. Furthermore, traumatic IVD cells demonstrated significantly reduced expression of the mitochondria-bound anti-apoptotic Bcl-2, thereby maintaining baseline transcriptional levels of the pro-apoptotic Bax protein when compared to control IVD cells. CONCLUSION: Our data suggest that thoracolumbar fractures induce early caspase-dependent apoptosis in IVD cells of the affected intervertebral disc, in part, by downregulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 (intrinsic apoptosis pathway), as well as signalling via the death receptor complex (TNFR I and FasR)
Moving Targets, Long-Lived Infrastructure, and Increasing Needs for Integration and Adaptation in Water Management: An Illustration from Switzerland
Ro/SSA52 autoantigen, associated with SLE, shows an enhanced mRNA and protein expression in human keratinocyte by TNF-stimulation
Der systemische Lupus erythematodes ist eine klassische Autoimmunerkrankung,
die unterschiedliche Organe betrifft und durch das Vorkommen einer Vielzahl
von Autoantikörpern, die u.a. gegen nukleÀre und zytoplasmatische Autoantigene
gerichtet sind, gekennzeichnet ist. Autoantikörper gegen das nukleÀre
Ribonukleoprotein Ro/SSA sind ĂŒberdurchschnittlich hĂ€ufig mit photosensitiven
Hauterscheinungen assoziiert und werden in 50% der Seren von Patienten mit SLE
sowie in mehr als 80% der Seren von Patienten mit Sjögren-Syndrom, subakut
kutanem Lupus sowie neonatalem Lupus detektiert. Die dabei entstehenden Ro
/SSA-Immunkomplexe lassen sich insbesondere in der Epidermis von SLE-Patienten
nachweisen 104,105. Zytokine wie TNF- sind an der Membranexpression des
intrazellulÀren Ro/SSA52-Proteins in humanen Keratinozyten beteiligt 30,106.
In dieser Arbeit wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Ro/SSA52
-mRNA-Expression in humanen Keratinozyten etabliert. Durch die Realtime-PCR
können mittels relativer Quantifizierung und interner Kontrolle durch GAPDH
hochsensitiv Ro/SSA52-mRNA-Produkte detektiert werden. Das Maximum der
Ro/SSA52-mRNA-Expression wird in primÀren Keratinozyten wie auch in der
humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT nach 4h erreicht. Die Keratinozyten
verschiedener gesunder Personen sind hierbei unterschiedlich empfindlich auf
die Behandlung mit dem Zytokin. In der HaCaT-Zelllinie lÀsst sich eine
deutlich höhere Ro/SSA52-mRNA-Expression als in primÀren Zellen beobachten.
Die Induktion der Ro/SSA52-mRNA-Expression wird ĂŒber den TNF-Rezeptor I
vermittelt, wĂ€hrend der TNF-Rezeptor II die ĂŒber den TNF-Rezeptor I
hervorgerufene Expressionserhöhung von Ro/SSA52-mRNA unterdrĂŒckt. TNF-
induziert die Freisetzung von sekundÀren proinflammatorischen Zytokinen wie
IL-6 und IL-8 sowie die des antiinflammatorischen Zytokins IL-10. DarĂŒber
hinaus fördert TNF- in primÀren Keratinozyten nach 24h Stimulation seine
eigene vermehrte Freisetzung und ist 100-fach erhöht nachweisbar. IL-6 und
IL-8 weisen eine maximale Freisetzung schon nach 4h auf und sind siebenfach
bzw. 20-fach erhöht detektierbar. Die Realtime-PCR ist eine sehr sensitive
Methode zur Bestimmung der mRNA-Expression des Ro/SA52-Autoantigens in
Keratinozyten, die anderen bislang verwendeten Methoden wie der konventionelle
PCR oder dem Northern-Blot ĂŒberlegen ist. Die Effekte von TNF- auf die
Induktion von Ro/SSA52-mRNA zusammen mit schon publizierten Daten zur
Ro/SSA52-Proteinexpression 30,127 deutet auf eine bedeutende Rolle von TNF-
bei Anti-Ro/SSA-assoziierten, inflammatorischen Hautmanifestationen bei
Patienten mit Lupus erythematodes hin. Der wesentliche pathophysiologische
Einfluss des Zytokins lÀsst den therapeutischen Einsatz von TNF--Blockern bei
photosensitiven, Anti-Ro/SSA-assoziierten kutanen Formen des Lupus
erythematodes vielversprechend erscheinen.Anti-nuclear antibody response is a frequent feature among a number of
systemic autoimmune diseases such as SLE or Sjögrens-Syndrome (SS). The immune
response in patients with rheumatic autoimmune diseases is remarkably focussed
on a particular group of nuclear self-antigens, including U1-RNP, Sm and
Ro/SSA. Reasons to explain why nucleoprotein complexes are most prominent
detected by autoantibodies remain unclear and are addressed to some extent by
their intracellular localization, high charge and immune-stimulatory capacity
of RNAs. Moreover, the immunogenicity was interpreted by the release of
dominant self-antigens from dying cells and accumulation on the surface of
apoptotic blebs, which led to an enhanced binding of autoantibodies. Commonly
used cells which have been chosen to explore Ro/SSA autoantibody binding are
skin keratinocytes. They vastly are detectable in the epidermal skin
compartment and are constantly in touch with external stimuli providing
comprehensive innate immune mechanisms. Anti-Ro/SSA autoantibodies, produced
in photosensitive LE may contribute directly in the pathogenesis, elucidated
by promotion of cell death in different target organs and by their deposition
in peripheral skin. Approximately 70% of the initial cohort of patients with
cutaneous Lupus (SCLE) either displayed abnormal amounts of anti-nuclear
antibodies (ANA) as well as anti-Ro/SSA-antibodies. The frequency of other
autoantibodies usually found in SLE patients such as double-stranded DNA and
Sm were seen far below to anti-Ro/SSA autoantibodies found in SCLE patients.
The deposition of IgG`s is apparently a common event in the skin of patients
with systemic or cutaneous lupus erythematosus. In about 90% of chronically
skin lesions and in about 60% of acute skin lesions immunoglobulins
permanently have been deposited. With regard to the complex nature of the
Ro/SSA autoantigen and its ubiquitous expression in mammalians, makes it
challenging to investigate how either the entire Ro/SSA autoantigen complex or
its merely protein components are exposed to autoantibodies. Concerning the
work of Dörner et al., inflammatory cytokines such as TNF- were identified to
induce the protein expression of Ro/SSA on primary human keratinocytes. In the
past decade the knowledge about mechanisms underlying reinforced accumulation
of the Ro/SSA autoantigen on apoptotic cells had been significantly improved
[13, 35, 36], while its mRNA and protein expression on viable cells in most
instances remained unsettled. By using highly sensitive real time PCR,
TNF--induced mRNA expression of Ro/SSA52 in non-apoptotic primary
keratinocytes and in keratinocyte cell line HaCaT was investigated. Ro/SSA52
mRNA expression peaked at 4h and is up-regulated by TNF-RI and inhibited by
TNF-RII. The TNF--induced enhanced mRNA expression resulted in an elevated
Ro/SSA52 protein expression after 24h. Although a small number of viable cells
relocate Ro/SSA52 mRNA on the cell surface, the activated, anti-Ro/SSA52
antibody-mediated cytotoxicity (ADCC) provided the evidence of the Ro/SSA52
protein functionality. We conclude that irrespective of induction of
apoptosis, Ro/SSA52 keratinocyte expression on viable cells may contribute to
the development of autoantibody-mediated photosensitive skin manifestations as
well as to the induction or maintenance of autoimmune responses
Development of a Ribozyme an DNAzyme mediated therapeutical strategy against allergy and asthma
GesamtdissertationDie komplexe Pathogenese allergischer Erkrankungen und des Asthma bronchiale
macht die Entwicklung neuer TherapieansÀtze notwendig. Von grundlegender
pathophysiologischer Bedeutung fĂŒr die Entstehung allergischer Erkrankungen
sind die Zytokine IL-4 und IL-13. In der IL-4- und IL-13-vermittelten
Signaltransduktion nimmt der Transkriptionsfaktor STAT6 eine zentrale Stellung
ein. Untersuchungen an stat6-knockout-MĂ€usen zeigen, daĂ stat6 fĂŒr die
AusprÀgung des allergischen PhÀnotypes wesentlich ist. Mit der Anwendung von
Ribozymen und DNAzymen wird eine therapeutische Strategie auf NukleinsÀure-
Basis zur spezifischen Spaltung der mRNA des Transkriptionsfaktors stat6 der
Maus verfolgt. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten mstat6-spezifischen
Ribozyme besitzen eine GUC-Konsensussequenz und 6 nt lange Bindungsarme.
Potentielle Ribozym-Spaltstellen werden auf der Grundlage von
SekundÀrstrukturberechnungen der mstat6-RNA identifiziert und liegen in
einzelstrĂ€ngigen Loop-Strukturen. FĂŒr eine stabile Expression werden die fĂŒr
die Ribozyme kodierenden Oligonuleotide in die Expressionskassette pGvaL
kloniert. Insgesamt finden drei mstat6-spezifische Ribozyme Verwendung, deren
AktivitÀt unter zellfreien Bedingungen getestet wird. Alle drei untersuchten
Ribozyme sind in-vitro nicht aktiv. Unter Verwendung eines Multiplex-
AktivitÀts-Assays wird auf der RNA des stat6 der Maus ein Screening nach
zugĂ€nglichen DNAzym-Spaltstellen vorgenommen. Die dafĂŒr eingesetzten DNAzyme
haben eine RU-Konsensussequenz (R = A, G) und besitzen Bindungsarme mit einer
LĂ€nge von jeweils 9 nt. FĂŒr die Lokalisation der Bindungsstellen ist die
thermodynamische StabilitĂ€t âG0 der DNAzym-Substrat-Heteroduplex entscheidend.
Die reziproke Korrelation von DNAzym-AktivitĂ€t und âG0 fĂŒhrt zur Auswahl von
41 DNAzym-Spaltstellen mit einem âG0 von jeweils †\- 25 kcal/mol im
Sequenzbereich von 150 - 600 bp sowie von 1,7 - 2 kb. FĂŒr die Auswahl des
Sequenzbereiches 1,7 - 2 kb ist die Beschreibung von humanen
stat6-SpleiĂvarianten von Bedeutung, da diese auf einer Deletion im
Sequenzbereich von 1765 - 1863 bp beruhen. Von den 41 im Multiplex-AktivitÀts-
Assay getesteten DNAzymen weisen acht DNAzyme eine SpaltungsaktivitÀt auf. Die
Testung aller acht DNAzyme in einem zellfreien System ergibt, daĂ sie ĂŒber
einen Zeitraum von 60 min aktiv sind. In weiterfĂŒhrenden Experimenten wird zu
prĂŒfen sein, ob die unter zellfreien Bedingungen aktiven DNAzyme auch in
Zellkulturen sowie allergischen Mausmodellen wirksam sind.The highly complex pathogenesis of allergic diseases such as asthma requires
the development of new and specific therapeutical approaches. Both
Interleukine-4 and Interleukine-13, respectively, are attributed to play an
essential role in the development of allergic asthma via activation of the
signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6). Investigation of
stat6-deficient allergic mice demonstrated that stat6 is critical involved in
the allergic phenotype. By the application of ribozymes and DNAzymes a nucleic
acid based therapeutical strategy was choosen to investigate whether murine
stat6 mRNA could be specifically cleaved in-vitro. Murine stat6-specific
ribozymes adopted a GUC consensus sequence with binding arms of both 6 nt and
were developed on the basis of computational secondary structure calculation
of the murine stat6 transcript. For stable ribozyme expression a recently
described pGvaL expression cassette was used. However; all tested ribozymes
did not show any in-vitro activity. With the use of a multiplex activity assay
the murine stat6 transcript was screened for DNAzyme cleavage sites. The
converse correlation between the thermodynamic stability of the DNAzyme-
substrate heteroduplex and an improved DNAzyme activity revealed potential
cleavage sites on the murine stat6 transcript. Within 41 DNAzymes tested in
the multiplex assay eight DNAzymes showed distinct cleavage activities on the
transcript. Subsequently, the results were strongly confirmed in a cell-free
system. The used DNAzymes had RU consensus sequences with R = A, G and binding
arms of 9 nt. Additional in-vitro analyses provide evidence that these
stat6-specific DNAzymes were active over a time period of 60 minutes. Further
experiments have to test the murine stat6-specific DNAzymes in cell based
systems and appropriate allergic mice models
Vom Expertenentscheid zum Risikodialog
Die Umsetzung nachhaltiger Hochwasserschutzprojekte ist ein Àusserst komplexer Prozess. Er erfordert eine detaillierte Analyse des Projektkontexts und den Einbezug aller Akteure. Als Entscheidungshilfe dient das im Rhone-Thur-Projekt erarbeitete Handbuch «Wasserbauprojekte gemeinsam planen»
Chromosome intrachanges and interchanges detected by multicolor banding in lymphocytes: searching for clastogen signatures in the human genome.
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