Purification and further characterization of the adenovirus type 2 endoprotease

Résumé : La protéase de l'adénovirus de type 2 a été exprimée dans E. coli ainsi que dans les cellules d'insecte (Sf9) en utilisant différentes méthodes de purification. L'activité protéolytique de l'enzyme a été mesurée à l'aide des substrats suivants:(l) les protéines précurseures radiomarquées du virion ts1, (2) la protéine adénovirale pré-VII canine recombinante, (3) la protéine pré-VI de l'adénovirus de type 2, (4) l'ovalbumine dénaturée, et (5) le peptide fluorogénique R110. L'activité comparable des deux préparations d'enzyme montre que les modifications post-traductionnelles ne sont pas requises pour l'activité protéolytique de l'enzyme. L'activité protéolytique de l'enzyme est présente même en absence du peptide activateur GVQSLKRRRCF (pVIc). Cependant le peptide pVIc est l'agent le plus efficace pour stimuler l'activité de la protéase. Nous avons montré que parmi les agents redox comme le B-mercaptoétbanol, le ditbiotbréitol, l'isomérase de thiol des protéines et la cystéamine, ce dernier est le plus puissant pour stimuler l'activité de l'enzyme. Les expériences de carboxymétbylation de la protéase de type sauvage et des mutants cystéines ont suggéré que le peptide pVIc réagit avec la Cysl7 ou la Cys40 via un mécanisme d'échange de ponts disulfures. Les isoformes in vitro ainsi que in vivo pour l'enzyme ont été identifiées. La structure secondaire de la protéase de type sauvage et celle du mutant ts1 prédite par le logiciel PHD suggère que la mutation P137L de ts1 se trouve dans une boucle externe riche en proline adjacente à la cystéine du site actif. Le profil de migration de l'enzyme sur le gel avec gradient d'urée a montré que l'enzyme est composée d'un seul domaine structural. Les spectres de dichroïsme circulaire de l'enzyme de type sauvage et du mutant ts1 obtenus aux températures permissives et non-permissives montrent que des changements structuraux très subtils sont à l'origine du phénotype ts1. || Abstract: Adenovirns type 2 protease was expressed in E. coli as well as in insect cells (Sf9) and purifîed to homogeneity using differant methods of purification. Protease activity was measured by means of several different assay Systems and substrates: (1) labeled viral precursor proteins from ts1, (2) recombinant canine adenovirus pre-VII protein, (3) adenovirus type 2 pre-VI protein, (4) denatured ovalbumin and (5) a fluorogenic peptide. The comparable activity of the two enzyme preparations showed that posttranslational modifications were not necessary for proteolytic activity of the enzyme. Proteolytic activity of the enzyme was observed in the absence of the activating peptide GVQSLKRRRCF (pVIc). Nevertheless pVIc was the most efficient agent in stimulation or even restoration of the enzyme activity. The effect of redox agents such as B-mercaptoethanol, dithiothreitol, protein disulfide isomerase, and cysteamin was studied. The latter was the most efficient in stimulating enzyme activity. Carboxymethylation of the wild type enzyme and the mutants of conserved cysteines in combination with other results ruled out six of the eight cysteines as the targets of pVIc binding and suggests that pVIc reacts via a disulfide exchange mechanism with C17 or C40. Three in vivo and one in vitro isoform of the enzyme were identified. Computational-based secondary structure prediction of the wild type and ts1 enzymes suggested that the P137L mutation of ts1 is located in an extemal proline rich loop adjacent to the putative active residue C104. Urea gradient electrophoretic profiles of the enzymes indicated that the protease is comprised of a single conformational domain. Circular dichroism spectra of the wild type and the ts1 enzymes obtained at the permissive and the non-permissive temperature implied a very subtle structural change as the cause of the in vivo phenotype of the ts1 protease