Az RNS silencing mechanizmusának vizsgálata állati és növényi modelleken = Mechanism of RNS silencing in animal and plant model organism

A Cymbidium ringspot vírussal fertőzött növényekből származó kis RNS-ek analízise során azt találtuk, hogy a virális kis RNS-ek a genom kitüntetett helyeiről keletkeznek és a a virális kis RNS-ek 80%-a a pozitív, 20%-a a negatív szálról képződik. Ez az arány megegyezik a genomi RNS-ek szálarányával. Eredményeinkből az következik, hogy a virális kis RNS-ek nem a virus ds replikatív intermedierjéről, hanem az egyszálú genomi RNS-ek másodlagos szerkezettel rendelkező régióiról keletkeznek. Az RNS silencing szupresszorokkal végzett munkánk alapján megállapítottuk, hogy a vizsgált virális szupresszorok mind a növényi, mind az állati rendszerekben a kis RNS-ek megkötésével gátolják a RISC komplexek, ezáltal a si- és miRNS indukálta RNS silencing kialakulását. Mivel az általunk vizsgált vírusok taxonómiailag különböző családokba sorolhatók, ezért azt a következtetés is levonhatjuk, hogy a siRNS kötésen alapuló RNS silencing gátlás egy széleskörűen elterjedt RNS silencing szupressziós stratégia. Jól jellemzett kis RNS kötő RNS silencing szupresszorral rendelkező vírusok hatását vizsgáltuk a a kis RNS-ek 3 vessző vég metilációjára. Eredményeink azt mutatják, hogy a TEV HCPro hatékonyan, míg a CIRV p19 kevéssé gátolja meg a virális siRNS-ek és bizonyos endogén miRNS-ek 3 vessző végének metilációját. Sejtfrakcionálásos eredményeink alapján feltételezhetjük, hogy a kis RNS-ek metilációja nemcsak a sejtmagban, hanem a citoplazmában is bekövetkezhet. | A survey of virus-specific siRNAs characterized by a sequence analysis of siRNAs from plants infected with Cymbidium ringspot virus showed that viral siRNA sequences have a nonrandom distribution along the length of the viral genome, suggesting that viral siRNAs derived from highly structured regions of the single stranded viral genome, rather than the ds replicative intermedier. Analyzing several silencing suppressors representing different families of viruses showed that each inhibit the intermediate step of RNA silencing via binding to siRNAs, although the molecular features required for duplex siRNA binding differ among these proteins. None of the suppressors affected the activity of preassembled RISC complexes. In contrast, each suppressor uniformly inhibited the siRNA-initiated RISC assembly pathway by preventing RNA silencing initiator complex formation. We investigated the 3' modification of silencing-related small RNAs in plants infected with viruses expressing small RNA silencing suppressors. We found that CIRV had only a slight effect on viral siRNA 3' modification, but TEV significantly inhibited the 3' modification of si/miRNAs. This suggests that the 3' modification of viral siRNAs occurs in the cytoplasm, though miRNA 3' modification likely takes place in the nucleus as well

Az RNS silencing szerepe, mechanizmusa a vírus gazda kölcsönhatásban = The role and the mechanism of RNA silencing in the plant virus interplay

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik. Kutatásaink során feltártuk a Cymbidium ringspot vírus genomról kéződő small interferáló (si) RNS eredetét nagy hatékonyságú 454 (Life Science) és Soplexa (illumina) szekvenaló rendszerek alkalmazásával. A vírus genomról származó kis RNS-eket rátérképeztük a vírus genomjára, amely alapján "forró pontokat" tudtunk azonosítani. Igazoltuk,hogy virus siRNS-ek túlnyomó töbsége a virus pozitív száláról származik, és 21-22 nukleotid (nt) hosszú. Megállapítottuk, hogy vírus siRNS-ekkel töltött RISC (RNA Induced Silencing Complex) komplexek szekvenciaspecifikusan hasítják a vírus genomot. Számos silencing szupresszor fehérje (p19, HC-Pro, és p122) részletes analízisével igazoltuk, hogy a növény antivirális válaszát, a vírus kódolta silencing szupresszorok hatékonyan gátolják. Bizonyítottuk, hogy a siRNS-ek specifikus kötése és inaktiválása a legelterjedtebb stratégia a silencing szupresszor fehérjék között. Feltártuk, hogy a silencing szuppresszor fehérjék egy jelentős csoportja gátolja növények endogén siRNS és miRNS biogenezisét. A silencing szupressor feherjék interakciója az endogen silencing útvonalakkal feltehetően a magyarázata a vírus okozta tünetek kialakulásának, hiszen a szupresszor fehérjék súlyosan zavarja növény egyedfejlődését. | RNA silencing is a gene inactivation mechanism, which is conserved in a broad range of eukaryotes. The central players in RNA-mediated gene silencing are the small 21-24 nucleotide long RNA molecules engaged in sequence-specific interactions to inhibit gene expression. RNA silencing fulfils fundamental regulatory roles, as well as antiviral functions. We profiled viral siRNAs using two different high-throughput sequencing platforms. Both deep sequencing techniques revealed a strong bias in viral siRNAs for the positive strand of the virus and identified regions on the viral genome that produced viral siRNA in much higher abundance than other regions. We also analysed the viral RNA targeting by virus induced gene silencing in tombusvirus infected plants, and we show evidence that antiviral response is based on viral RNA cleavage by RNA-induced silencing effector complex (RISC) programmed by virus-specific siRNAs.. To counteract RNA silencing, viruses express silencing suppressors that interfere with both siRNA- and microRNA-guided silencing pathways. We used comparative approaches to analyse the molecular mechanism of suppression by three well-studied silencing suppressors. We found that silencing suppressors p19, p21 and HC-Pro each inhibit the RISC assembly. We demonstrated that these suppressors are able to interact with the endogenous silencing pathways suggesting that these interactions have an important role in the development of virus-induced symptoms