SIN001, drug for improvement of the embryonic implantation. Study of endometrial markers in clinical regulatory phase

Motivation:The study of endometrial receptivity has opened a new approach in the world of assisted reproduction, allowing the development of genetic tests, drugs and techniques that increase the rate of “child at home” mainly in couples who are attending to assisted reproduction programmes. Genetic tests about endometrial receptivity allow to evaluate the “window of implantation” (WOI) estimating the best moment for successful embryo transfer, decreasing the maternal factor. Due to the progress of these tests it can be considered if drugs like SIN001, improve endometrial receptivity in clinical phase. Methods:Through the endometrial biopsy before and after the intake of the drug SIN001 of 32 women in a natural cycle, the transcriptome is analysed, after extracting RNA, using quantitative PCR in microfluidics technique (Fluidigm technology). It consists of a dynamic array where the samples and the primers of the genes, in this case 192 markers previously described and related to the endometrial receptivity, are combined in a real-time PCR. A pre-treatment and treatment histological determination can be obtained due to the endometrial biopsy, for the expression and localization of some of the proteins that have been defined as important in endometrial receptivity.Results: In the preclinical in vitro tests obtained with the drug SIN001, the toxicity was dismissed and the adhesion increase was observed in cell culture models and in primary cultures models of endometrial epithelium. In this clinical phase is expected to improve the WOI in women after the intake of the drug and therefore the embryo implantation. In addition, to evaluate the receptive status of the women with the endometrial receptivity test and also it is expected to establish the expression profile of the 192 genes in the transcriptomics, as well as an evaluation of the proteins obtained in immunohistochemistry.Conclusions: Currently there are no drugs improving embryo implantation, this means that the discovery of a substance like SIN001, significantly increase the probability of success in reproduction clinics, since the drug is expected to cover three phases: (i) endometrial preparation; (ii) embryo implantation; (iii) placentation and prevention of spontaneous miscarriage. Therefore, the next steps to scale up the drug to market would be to increase the cohort of the study and studies focusing on the action mechanism of the drug SIN001 in endometrium

Encapsulación de células endometriales para el co-cultivo de embriones

Motivación: En la fecundación in vitro (FIV) se transfiere el embrión el dia 5, en el estadío de mórula-blastocito, para asegurar que se desarrolle correctamente y que haya menor probabilidad de aneuploidias. En pacientes con fallo de implantación, se desarrollo un método seguro, ético y efectivo para el co-cultivo con células epiteliales de endometrio (Simón y cols., 1999). Estos se siguen realizando de rutina en muchas clínicas, pero presentan una serie de desventajas como las contaminaciones bacterianas o fúngicas y la imposibilidad de llevarse a cabo en laboratorios externos que dificultan su trabajo. Este proyecto esta encaminado a implantar un nuevo método en las clínicas por sus ventajas: mejora de la calidad embrionaria, ahorro de tiempo en los laboratorios del FIV, mejora de la calidad del co-cultivo evitando posibles contaminaciones y un abaratamiento del sistema de co-cultivo al no tener que realizar el cultivo en los laboratorios FIV. Métodos: Se toman pequeñas biopsias endometriales mediante una fina cánula procedentes de donantes en los laboratorios FIV. Tras su obtención, se sigue un protocolo para la separación de epitelio y estroma (Simón y cols., 1999), en las que la mitad de las células epiteliales son encapsuladas en alginato cálcico y la otra mitad son sembradas en monocapa. Actualmente, estamos recogiendo los medios de cultivo tanto de las células encapsuladas como de las células en monocapa, los días 2, 4, 8 y 10 tras alcanzar la confluencia una vez han sido sembradas después de la encapsulación. Se analizarán en estos medios la presencia de factores que previamente han sido descritos en medios de cultivo de células epiteliales endometriales como IL-6. Se realizarán ensayos de ELISA para las proteínas secretadas y de Western para las células recogidas. Se correlacionarán los niveles de proteínas existentes en el medio con los medios de cultivo de las células en monocapa. Conclusiones: Tras la obtención y procesamiento de biopsias como se indico anteriormente, se demostró la viabilidad de las células endometriales en capsulas de alginato cálcico. Este sistema ofrece la posibilidad de desarrollar un nuevo método de implantación en las clínicas FIV mejorando los sistemas de co-cultivo actuales

Diseño y validación de un array de SNPs para la detección de enfermedades monogénicas

Motivación: Las enfermedades monogénicas actualmente afectan a más de 20 millones de personas sólo en los Estados Unidos, causando una tasa de mortalidad infantil superior a 20%. La era científica en que vivimos nos permite conocer la carga genética de un embrión y la posibilidad de evitar nacimientos con enfermedades concretas que suponen una importante pérdida en la calidad de vida tanto del niño afecto, como del ambiente que le rodea. Sin embargo, las técnicas utilizadas hasta ahora para diagnóstigo genético preimplantacional resultan costosas y sólo permiten analizar un número pequeño de enfermedades siendo más habituales principalmente en aquellos casos en los que se presentan antecedentes familiares. En este contexto surge el Array Recombine, con el que podemos detectar en los progenitores, sin necesidad de conocer antecedentes familiares, 152 de las enfermedades monogénicas de mayor penetrancia, a través del análisis de 940 mutaciones. Métodos: Utilizamos una plataforma de Illumina (Illumina Infinium HD Assay) la cual permite el análisis de porlimorfismos de un nucleótido. El uso de esta plataforma implica mejoras tanto en la velocidad de análisis, como en la cantidad de mutaciones que se pueden analizar y el coste, el cual se reduce notablemente. Hemos elegido un array debido a que la técnica es bien conocida, de alta precisión y que ofrece call rates mayores del 99%. El Infinium Assay consiste en la hibridación de fragmentos de DNA genómico con cebadores sintéticos, los cuales están unidos a perlas de sílice, hasta un punto determinado en el que se añade una base en una reacción que emite una fluorescencia específica para A o T, con lo que permite conocer el genotipo en un punto concreto, relacionado con el desarrollo de una enfermedad genética en la progenie de una pareja portadora de dicho genotipo alterado. Las enfermedades incluídas se determinan siguiendo las recomendaciones de la ACOG y ACMG, así como la incidencia y el impacto de determinadas enfermedades genéticas. Resultados: Al comparar los resultados obtenidos mediante el array, con genotipos estudiados por secuenciación, se confirma que este ensayo es válido como prueba de diagnóstico genético preconcepcional, al no haber obtenido en ninguno de los casos falsos positivos o negativos, confirmando así una precisión del 100% para esta prueba. Conclusiones: El conocimiento de portadores de mutaciones puntuales permite evitar nacimientos de niños con graves enfermedades genéticas

Desarrollo de una nueva herramienta diagnóstica para redefinir la firma molecular de la receptividad endometrial

Motivación: La implantación embrionaria es un proceso que tiene lugar durante un breve periodo de tiempo donde el tejido endometrial alcanza un estado receptivo y donde se expresan moléculas que son necesarias para el proceso de implantación y posterior invasión del embrión. Este periodo se conoce como ventana de implantación y tiene lugar alrededor del día 20-21 del ciclo menstrual. El endometrio receptivo ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista histológico y molecular, y se conocen gran número de marcadores que forman parte de la firma molecular del endometrio receptivo, lo cual ha servido para desarrollar herramientas moleculares genómicas para el diagnóstico de la receptividad endometrial con utilidad clínica. Sin embargo, hasta ahora no se ha tenido en cuenta que la capacidad receptiva del endometrio tiene un componente inmunológico importante que facilita la entrada del tejido embrionario en el tejido materno. Este estudio pretende caracterizar el endometrio a nivel molecular, teniendo en cuenta tanto factores necesarios para la receptividad endometrial como para el control de la respuesta inmunológica.Métodos: 1 y 2. Selección de los marcadores de receptividad endometrial y respuesta inmunitaria tras revisión bibliográfica exhaustiva. Se seleccionaron 192 marcadores moleculares. 3. Diseño de los oligonucleótidos para la realización del test, compatibles con la novedosa plataforma Fluidigm, las cuales están siendo validadas en la Universidad para el posterior estudio de expresión. 4. Estudio prospectivo de la expresión de dichos marcadores en muestras las humanas que desde el principio del proyecto se han estado recogiendo. 5. Análisis de los datos obtenidos.Resultados: De momento se están validando las sondas de oligonucleótidos diseñadas para el Fluidigm. Una vez acabado este paso se iniciará el estudio con las muestras tomadas. Lo que esperamos es determinar los mejores marcadores para la receptividad endometrial, incluyendo algunos nuevos, y que el Fluidigm funcione como nueva plataforma para el desarrollo de la nueva herramienta diagnóstica de la receptividad endometrial en la que estamos trabajando.Conclusiones: La mejor y más exhaustiva caracterización del proceso de receptividad endometrial permitirá un mayor éxito en los tratamientos de fertilidad a los que se ven sometidas cada vez más parejas, y el uso del Fluidigm, además, redundará en una disminución de los costes económicos y el trabajo del investigador

Búsqueda de marcadores de embarazo ectópico en sangre periférica

Motivación: El embarazo ectópico es una anomalía en la implantación embrionaria y complicación ginecológica grave que afecta a más de un 1% de los embarazos naturales y hasta un 8% de las embarazadas en reproducción asistida, según las fuentes. Los métodos diagnósticos de embarazo ectópico a día de hoy se basan exclusivamente en métodos ecográficos y en medidas seriadas de B-hCG métodos que, en muchas ocasiones, se prolongan por una semana o más, para llegar a un diagnóstico fiable.En el Reino Unido el diagnóstico del embarazo ectópico genera un gasto anual de 12 millones de euros², datos extrapolables al resto de Europa. La existencia de un buen marcador de embarazo ectópico sustituiría la realización del test diario de β-hCG, siendo el mercado potencial de unos 13 millones de análisis por año.Métodos: Se recogieron seis muestras de sangre procedentes de mujeres con embarazo ectópico y otras seis de mujeres con embarazo intrauterino con edades gestacionales similares (entre 7 y 10 semanas) se almacenaron a -20ºC en tubos PAXGene hasta su posterior análisis. La extracción del RNA se realizó utilizando el método del Trizol (Sigma-Aldrich). Todas las muestras fueron hibridadas utilizando el “Whole Human Genome Oligo Microarray” (Agilent Technologies) que contiene mas de 44.000 sondas para el genoma humano. El microarray hibridado se escaneo mediante el escaner Axon 4100 (Molecular Devices) y los datos se extrajeron con el software Genepix 6.0 (Molecular Devices). El análisis de datos se llevo acabo con la plataforma GEPAS. Resultados: Se utilizaron seis muestras de embarazo ectópico y seis muestras de embarazo intrauterino para el análisis de microarray. Se generó una lista de 17 potenciales marcadores de embarazo ectópico con un fold change >4 o <-4 y con un p valor <0.05. De estos 17 genes se han validados por PCR cuantitativa los siguientes: ORM1, ORM2, LAMP3 y UTS2 utilizando nuevas muestras de embarazo ectópico (n=8) y de embarazo intrauterino (n=7). Después de descartar los valores atípicos se confirmaron algunos resultados del microarray.Conclusiones: Los resultados del microarray mostraron un total de 17 genes desregulados entre embarazos ectópicos e intrauterinos, concretamente 10 se sobre expresaban y 7 de ellos disminuían su expresión. Los genes ORM1, ORM2, LAMP3 y UTS2 se comprobaron por qPCR y mostraron diferencias significativas. . Al final de este estudio se comprobaran el resto de genes y se podrá diseñar un test de embarazo ectópico

Demosponge diversity from North Sulawesi, with the description of six new species

Volume: 680Start Page: 105End Page: 15

Evaluación de la calidad seminal en pilotos de vuelos internacionales transoceánicos

Motivación: El factor masculino en reproducción está presente en la mitad de los casos de infertilidad, un problema de salud pública en auge en las ultimas décadas. Muchos estudios han demostrado que la calidad seminal se ha visto afectada por los contaminantes ambientales y los cambios en el estilo de vida, que pueden inducir procesos de fragmentación del DNA espermático o inducir estrés oxidativo(1). El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la calidad seminal de un grupo concreto, los pilotos de vuelos transoceánicos que, por su profesión, pueden suponer un grupo de riesgo de problemas de fertilidad debido a sus condiciones laborales. Los cambios constantes de presión, temperatura y estación, pueden ocasionar daños a nivel celular con afectación del DNA, que implique procesos de fragmentación masiva y, consecuentemente, una disminución o pérdida de la fertilidad con el subsecuente fracaso en el embarazo. Este trabajo también pretende poner de manifiesto la necesidad de un seminograma avanzado, mas allá de los parámetros básicos analizados convencionalmente.Métodos:Se llevó a cabo un seminograma estándar para evaluar concentración, volumen, motilidad, morfología y vitalidad, con ayuda de sistemas informáticos (SCA) para los ensayos de concentración y motilidad, microscopía tanto de campo claro como de fluorescencia, así como el kit Vitaltest para el ensayo de vitalidad.Para el análisis de fragmentación de DNA se realizaron 2 ensayos: el SCD (Sperm Chromatin Dispersion) para evaluar la fragmentación total (2) y el ensayo COMET, el cual identifica específicamente las roturas de cadena doble(3). Ambos se realizaron mediante la utilización de kits comerciales (Halotech DNA) y microscopía de fluorescencia para su recuento.Asimismo se realizó un ensayo para medir el estrés oxidativo, también mediante el uso de un kit comercial para un análisis colorimétrico (Halotech DNA).Conclusiones: A pesar de no tener aún los resultados necesarios, hay muchos estudios que demuestran que la calidad seminal, sobre todo respecto al DNA, se ve afectada por múltiples factores, ya sean ambientales, genéticos o referentes al estilo de vida, por lo que cabe esperar que este grupo concreto se vea afectado negativamente debido a sus condiciones laborales. Cada vez van surgiendo mas casos en los que el DNA espermático está tan dañado, que el ovocito es incapaz de reparar ese daño, con lo que se justifica el uso de un seminograma avanzado que estudie el material genético

Análisis de la expresión de marcadores tumorales en muestras de tumores humanos

Motivación: Los últimos datos de la OMS muestran una incidencia de 14,1 millones de casos nuevos de cáncer y 8,2 millones de muertes por cáncer en el mundo, siendo el cáncer de pulmón el principal causante de muerte por cáncer en hombres y el cáncer de mama en mujeres (1). En la actualidad existen varios test genómicos que han identificado huellas genómicas de tipos específicos de cáncer como Ampliseq, Oncotype Dx o MammaPrint, pero sólo unos pocos incluyen datos clínicos a parte de los genéticos. El análisis de expresión de los marcadores que forman dichos test permiten predecir la evolución del tumor o la respuesta a tratamiento (2). El objetivo del proyecto es generar un test genómico basado en una huella genómica de cáncer de mama de 40 genes y otro basado en una huella de 36 genes de adenocarcinoma de pulmón. Estos test permitirán estratificar a los pacientes en tres grupos de riesgo y predecir la supervivencia de los mismos (3). En paralelo pretendemos analizar la expresión de genes que codifican bombas de detoxificación implicadas en la resistencia a quimioterapia (MDR, multidrug resistance).Métodos: De los 75 genes incluidos en el análisis de expresión se seleccionaron por un lado 32 genes de cáncer de mama, 30 genes de adenocarcinoma de pulmón y 6 genes de expresión constitutiva usados en los test genómico-clínicos patentados de Dueñas y col. (3); por otro lado, se hizo una revisión bibliográfica para seleccionar genes de transportadores ABC. A partir de ADNc de las biopsias y los primers diseñados se analizará la expresión de los marcadores en una plataforma BioMark 96.96 IFC Dynamic Array (Fluidigm). Esta plataforma es barata, sencilla y permite analizar la expresión de hasta 96 genes de forma simultánea mediante PCR cuantitativa.Resultados: De momento hemos diseñado los primers para todos los marcadores y hemos amplificado mediante PCR estándar 65 de los 75 marcadores. A continuación, los productos de PCR serán secuenciados para confirmar que corresponden a los marcadores y se analizará su expresión en cada muestra tumoral mediante PCR cuantitativa.Conclusiones: El análisis estadístico de los datos de qRT-PCR de las muestras de tumores humanos permitirá conocer que genes se encuentran sobre-expresados y cuales reprimidos en cada tumor; pudiendo predecir la evolución de la enfermedad en cada paciente y diseñar protocolos de quimioterapia más eficientes, acercándonos a la medicina personalizada

Análisis bioinformático de la expresión génica del endometrio tras el tratamiento con DIU

Motivación: El conocimiento de los niveles de expresión génica (y su posterior análisis funcional) de células endometriales tras el tratamiento con DIU puede jugar un papel fundamental en la búsqueda de drogas/fármacos que emulen el papel anticonceptivo del DIU y que de esta forma puedan ser usados en el tercer mundo como una opción anticonceptiva más barata que las usadas en paises desarrollados. Métodos: El trabajo parte de una publicación realizada en el año 2006 en la cual se realiza el estudio de microarrays para observar como varíaban perfiles de expresión génica endometriales tras la exposición de los mismos a un DIU. Los resultados mostraron que un total de 145 genes variaban de forma significativa su expresión tras la exposición al DIU. Ahora lo que buscamos es realizar el analisis funcional de los mismos, a través de tres métodos: 1-Gene Ontology, que permite la clasificación de los mismos; 2-Pubmatrix, que muestra la incidencia de dichos genes en otras publicaciones existentes, y por tanto su peso; 3-STRING, herramienta para la elaboración de redes neuronales que muestran de forma visual las interacciones intergénicas de los genes que resultaron significativos, según diversos criterios. Resultados: Los resultados del estudio inicial mostraron que, tras la inserción del DIU y su posterior retirada al mes, no se recuperaban los valores de expresión génica iniciales, si no que se mantenían y no se recuperaban hasta pasado un año. Los resultados del análisis funcional de los genes que se vieron afectados por la introducción del DIU son expuestos en forma de gráficas y figuras, con una pequeña reflexión a nivel biológico de lo que se encuentre más significativo como conclusión de lo actualmente trabajado

Intervención en adicciones: hacia una intervención centrada en la persona desde el Aprendizaje-Servicio

Depto. de Farmacología y ToxicologíaFac. de MedicinaUniversidad Complutense de Madrid. Proyectos ApSsubmitte