Further investigations of the population dynamics and pathogenicity of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer 1934) Nickle 1970, and its non-vector transmission to Pinus sylvestris

Der Kiefernholznematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner und Buhrer) Nickle 1970, führt in anfälligen Koniferenarten, hauptsächlich Pinus spp., außerhalb seines natürlichen Verbreitungsgebietes (Nordamerika) und in nicht heimischen Kiefernarten zur sogenannten Kiefernwelkekrankheit. Er ist seit seiner Einschleppung nach Asien und Europa zum schädlichsten pflanzenparasitären Nematoden von Bäumen geworden. Erkrankte Bäume welken und sterben. Derzeit betroffene europäische Länder sind Portugal und Spanien. B. xylophilus ist in der Europäischen Union (EU) aufgrund der zu beobachteten Gefahr in Befallsländern als ein Quarantäneschädling gelistet. In dieser Doktorarbeit, die Teil eines EU-Forschungsvorhabens der EU-Kommission ist, wurden Untersuchungen zur Unterstützung der Schädlingsrisikoanalyse, Managementstrategien und Notfallplanung der EU-Pflanzengesundheitspolitik durchgeführt. Die Übertragung von B. xylophilus zu neuen Wirtsbäumen findet üblicherweise über Vektorkäfer der Gattung Monochamus statt. Es wurden jedoch B. xylophilus in importierten Holzhackschnitzeln mit Ursprung Nordamerika in der EU beanstandet und die Nachfrage nach Hackschnitzelimporten aus Nordamerika steigt. Daher ist das phytosanitäre Risiko der nicht-vektorassoziierten Übertragung von B. xylophilus mittels Hackschnitzeln von Interesse. Darüberhinaus stellte sich heraus, dass Pinus sylvestris, eine in Deutschland und Nordosteuropa weitverbreitete Baumart, in Gewächshausversuchen mit Sämlingen höchst anfällig gegenüber B. xylophilus ist. In Europa wurden bisher noch keine erwachsenen Bäume dieser Art getestet. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit bestand aus einer Bewertung von potenziell toleranten oder resistenten Wirtsbaumherkünften als eine Managementoption der Kiefernwelkeerkrankung in betroffenen Ländern. Das Langzeitüberleben von B. xylophilus in Hackschnitzeln and seine nicht-vektorassoziierte Übertragung von befallenen Hackschnitzeln zu unbefallenen Bäumen wurden untersucht. Mit B. xylophilus befallene Hackschnitzel wurden hergestellt, indem eine Suspension bestehend aus Nematoden und Leitungswasser in P. sylvestris Stämme inokuliert wurde. Während des Langzeitlagerungstests wurde das Überleben von B. xylophilus in versiegelten und offen gelagerten P. sylvestris Hackschnitzeln bei 15 °C und 25 °C untersucht. Für die Untersuchung der nicht-vektorassoziierten Übertragung wurden mit B. xylophilus befallene Hackschnitzel unter unterschiedlichen Testbedingungen an P. sylvestris Sämlinge platziert. Es wurden Untersuchungen mit sieben- bis achtjährigen Bäumen durchgeführt, um die Aussagefähigkeit der auf Sämlingen basierenden Analysen zur Populationsdynamik und Pathgenität des Schädlings für erwachsene P. sylvestris Bäume zu überprüfen. Die Bäume wurden mit einer B. xylophilus Suspension bestehend aus Nematoden und Leitungswasser künstlich inokuliert. Zur Nematodenextraktion während der Populationsdynamikuntersuchung wurden die Kiefern in 48 Segmente geteilt. Physiologische Änderungen und die Entwicklung von Welkesymptomen wurden bis zum Tod der Bäume aufgenommen. Die Pathogenität von B. xylophilus wurde gegenüber unterschiedlichen deutschen Kiefernherkünften (gemäß der Deutschen Herkunftsgebietsverordnung) untersucht. Hierfür wurden P. sylvestris Sämlinge mit einer B. xylophilus Suspension bestehend aus Nematoden und Leitungswasser künstlich inokuliert. In den versiegelten Hackschnitzeln wurde B. xylophilus bei 15 °C und 25 °C mehr als 1 Jahr lang gefunden. Dies war signifikant länger als die zu beobachtende Dauer für die Variante offen gelagert bei 25 °C. Weiterhin war die nicht-vektorassoziierte Übertragung mittels Hackschnitzeln durch Temperatur, Baumzustand und Hackschnitzelposition beeinflusst. Hauptsächlich waren Bäume bei 25 °C mit Stamm- oder Wurzelverletzungen plus Direktkontakt des verwundeten Pflanzenabschnitts mit befallenen Hackschnitzeln mit B. xylophilus befallen und zeigten eindeutige Symptome der Kiefernwelkekrankheit. Darüberhinaus war für stamm- und wurzelverletzte Kiefern nicht immer ein Direktkontakt mit befallenen Hackschnitzeln für die nicht-vektorassoziierte Übertragung nötig. Bei 15 °C wies eine mit B. xylophilus befallene Kiefer eindeutige Symptome der Kiefernwelkekrankheit auf. Zu Beginn der Populationsdynamikuntersuchung war B. xylophilus in der Inokulationsstelle und den benachbarten Segmenten lokalisiert. Bevor externe Welkesymptome entstanden, war B. xylophilus im gesamten Stamm, den benachbarten Astsegmenten, Wurzelhals und Wurzeln lokalisiert. Schließlich wurde B. xylophilus in allen Holz- und Wurzelsegmenten in Kombination mit einer Zunahme der Kiefernwelkeerkrankung und hohen Nematodendichten festgestellt. Kurz vor dem vollständigen Absterben der Bäume war die Baumspitze teilweise nematodenfrei und die darunter liegenden Baumsegmente waren stark mit Nematoden befallen. Während der Pathogenitätsuntersuchung starben alle mit B. xylophilus inokulierten Kiefern und zeigten einen signifikanten, aber unterschiedlich verlaufenden Abfall des Wasserpotentials in den Nadeln im Vergleich zu einer trockengestressten Variante. Alle getesteten P. sylvestris Herkünfte zeigten eine Mortalität von 100 %. Es wurde jedoch eine zeitlich signifikant unterschiedlich verlaufende Krankheitsentwicklung bei wenigen P. sylvestris Herkünften gefunden. Schlussfolgernd betrachtet wurden das Langzeitüberleben in Hackschnitzeln und die nicht-vektorassoziierte Übertragung von befallenen Hackschnitzeln zu beschädigten Bäumen klar aufgezeigt, obwohl eine solche Etablierung weniger wahrscheinlich als eine Ausbreitung über Vektoren sein sollte. Diese Ergebnisse sollten in Freilandversuchen getestet werden. P. sylvestris Sämlinge sind gute Indikatorbäume für Untersuchungen der Populationsdynamik und Pathogenität von B. xylophilus, weil die Ergebnisse in sieben- bis achtjährigen P. sylvestris Bäumen vergleichbar zu denen in Sämlingen waren, auch wenn das Erreichen eines Populationsmaximums und die Entwicklung von Welkesymptomen zeitlich verzögert waren. Die Phänomene verspäteter Symptomentwicklung und verspäteten Baumtodes einiger Kiefernherkünfte sollten hinsichtlich potenzieller Abwehreigenschaften näher überprüft werden. Es wird eine fortlaufende Suche nach toleranten oder resistenten Herkünften oder Individuen für Kreuzungsvorhaben als Teil einer phytosanitären Langzeitstrategie gegen B. xylophilus vorgeschlagen. Alles in allem müssen die von befallenen Hackschnitzeln ausgehende Gefahr und das hohe Risiko für P. sylvestris Wälder bei der Schädlingsrisikoanalyse, den Managementstrategien und der Notfallplanung Berücksichtigung finden.The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle 1970, is the causal agent of the so-called pine wilt disease in susceptible conifer species, mainly Pinus spp., outside its natural range (North America) and in non-native pine species. Since its introduction to Asia and Europe, it has become the most harmful plant parasitic nematode of trees. Diseased trees wilt and die. Currently affected European countries are Portugal and Spain. Because of the observed threat in infested countries, B. xylophilus is listed as a quarantine pest in the European Union. In this PhD thesis, which is part of a European Union research project of the European Union Commission, investigations were conducted to support the pest risk analysis, management strategies and contingency planning of European Union Plant Health policy. The transmission of B. xylophilus to new host trees is commonly by vector beetles of the genus Monochamus. However, B. xylophilus have been complained in wood chips with origin North America imported to the European Union, and the demand for wood chip imports from North America is increasing. Therefore, the phytosanitary risk of non-vector transmission of B. xylophilus by wood chips is of interest. Moreover, Pinus sylvestris, a widespread tree species in Germany and northeastern Europe, was found to be highly susceptible to B. xylophilus in greenhouse trials using saplings. In Europe, mature trees of this species have not yet been tested. The third part of this thesis was an evaluation of potentially tolerant or resistant host tree provenances as an option for management of pine wilt disease in affected countries. The long-term survival of B. xylophilus in wood chips and its non-vector spread from infested wood chips to non-infested trees were investigated. B. xylophilus-infested wood chips were produced by inoculating a nematode-tap water suspension into P. sylvestris logs. During the long-term storage test, the survival of B. xylophilus was studied in sealed and openly stored P. sylvestris wood chips at 15 °C and 25 °C. For the investigation of non-vector spread, B. xylophilus-infested wood chips were placed on P. sylvestris saplings under different conditions. Investigations using seven- to eight-year-old trees were conducted to examine the significance of sapling-based analyses of the population dynamics and pathogenicity of the pest for mature P. sylvestris trees. The trees were artificially inoculated with B. xylophilus using a nematode-tap water suspension. For nematode extraction during the population dynamics investigation, the pines were divided into 48 segments. Physiological changes and the development of wilt symptoms were recorded until tree death. The pathogenicity of B. xylophilus towards different German pine provenances (according to the German Legal Ordinance on Regions of Provenance) was studied. For this purpose, P. sylvestris saplings were artificially inoculated with B. xylophilus using a nematode-tap water suspension. In the sealed wood chips, B. xylophilus was found for more than 1 year at 15 °C and 25 °C. This was significantly longer than the duration observed for the variant openly stored at 25 °C. Furthermore, non-vector spread through wood chips was influenced by temperature, tree condition and wood chip location. Trees with stem or root injuries plus direct contact of the wounded part with infested wood chips at 25 °C were primarily B. xylophilus-infested and showed clear symptoms of pine wilt disease. Moreover, for stem- and root-injured pines, direct contact with infested wood chips was not always necessary for non-vector spread. At 15 °C, one B. xylophilus-infested pine exhibited clear symptoms of pine wilt disease. At the start of the population dynamics investigation, B. xylophilus was located at the inoculation site and in adjacent segments. Before any external wilt symptoms developed, B. xylophilus was located in the entire stem, adjacent branch segments, root collar and roots. Finally, B. xylophilus was detected in all wood and root segments in combination with an increase in pine wilt disease and high nematode densities. Shortly before tree death, the treetop was partly nematode-free, and the subjacent tree segments were highly nematode-infested. During the pathogenicity investigation, all B. xylophilus-inoculated pines died and exhibited a significant but variable decline in the water potential in the needles compared to a drought-stressed variant. All tested P. sylvestris provenances showed a mortality of 100 %. However, significant differences in the time course of disease development were found for a few provenances. In conclusion, long-term survival in wood chips and non-vector transmission from infested wood chips to damaged trees were clearly shown, although such establishment should be less likely than spread via vectors. These findings should be tested in outdoor trials. P. sylvestris saplings are good indicator trees for investigations of B. xylophilus population dynamics and pathogenicity because the results in seven- to eight-year-old P. sylvestris trees were comparable to those in saplings, although delayed in reaching a population peak and developing wilt symptoms. The phenomena of delayed symptom development and delayed tree death of some pine provenances should be more closely examined with respect to potential defence traits. An ongoing search for tolerant or resistant provenances or individuals for cross-breeding purposes is suggested as part of a long-term phytosanitary strategy against B. xylophilus. Overall, the threat based on infested wood chips and the high risk for P. sylvestris forests must be considered in pest risk analysis, management strategies and contingency planning

Population dynamics and pathogenicity of Bursaphelenchus xylophilus in seven- to eight-year-old Pinus sylvestris trees

Der Kiefernholznematode, Bursaphelenchus xylophilus, ist der schädlichste pflanzenparasitäre Nematode an Bäumen in Asien und Europa und führt bei anfälligen Koniferenarten, hauptsächlich Pinus spp., zur sogenannten Kiefernwelkekrankheit. Die Krankheit ist lediglich außer­halb seines natürlichen Verbreitungsgebietes (Nordamerika) oder an nicht einheimischen Kiefernarten aufgetreten. In Gewächshausversuchen mit Sämlingen war Pinus sylvestris eine der anfälligsten europäischen Kiefern­arten. Um die Aussagefähigkeit dieser auf Sämlingen basieren­den Analysen bezüglich der Populationsdynamik und der Pathogenität für erwachsene P. sylvestris Bäume zu überprüfen, wurden Untersuchungen an sieben- bis achtjährigen Bäumen durchgeführt. Die Bäume wurden mit einer Suspension bestehend aus 10.000 B. xylophilus in 600 μl Leitungswasser pro Baum künstlich inokuliert. Für die Populationsdynamikuntersuchung wurden die Kiefern zur Nematodenextraktion in 48 Segmente geteilt. Die Entwicklung der Welkesymptome und physiologischen Änderungen wurden bis zum Tod der Bäume beobachtet.Während der Populationsdynamikuntersuchung war B. xylophilus in den ersten 11 Tagen nach Inokulation in der Inokulationsstelle und den benachbarten Segmenten lokalisiert. Am Tag 16 war B. xylophilus im gesamten Stamm, den benachbarten Astsegmenten, Wurzelhals und Wurzeln verteilt, noch bevor äußere Welkesymptome erschienen. Mit zunehmender Kiefernwelkeerkrankung war B. xylophilus schließlich in allen Holz- und Wurzelsegmenten zu finden. Hohe Nematodendichten traten auf. Kurz vor dem vollständigen Absterben der Bäume zeigte die Baumspitze mehrere nematodenfreie Segmente. Die restlichen Stamm- und benachbarten Astsegmente und der Wurzelhals waren in hohem Maße mit Nematoden befallen. Während der Pathogenitätsuntersuchung starben alle B. xylophilus-inokulierten Kiefern innerhalb von 84 Tagen. Der signifikante Abfall des Wasserpotentials in den Nadeln war steiler und stärker mit den zunehmenden Welkesymptomen korreliert als bei einer trocken­gestressten Vergleichsvariante. Der Abfall des Wasser­potentials in den Nadeln trat jedoch bei der trocken­gestressten Kiefernvariante früher ein. Schlussfolgend betrachtet waren die Populationsdynamik von B. xylophilus in sieben- bis achtjährigen P. sylvestris Bäumen und die pathologischen Reaktionen der Kiefern vergleichbar zu denen in Sämlingsuntersuchungen, auch wenn das Erreichen eines Populationsmaximums und die Entwicklung von Welkesymptomen zeitlich verzögert waren. Aus diesem Grund sind P. sylvestris Sämlinge gute Indikatorbäume für B. xylophilus Populationsdynamik- und Pathogenitätsuntersuchungen.The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is the most harmful plant parasitic nematode on trees in Asia and Europe and is the causal agent of the so-called pine wilt disease of susceptible conifer species, mainly Pinus spp. The disease has occurred only outside its natural range of distribution (North America) or on non-native pine species. In greenhouse trials using saplings, Pinus sylvestris was one of the most susceptible European pine species. To examine the significance of these sapling-based analyses concerning the population dynamics and pathogenicity for mature P. sylvestris trees, investigations using seven- to eight-year-old trees were carried out. The trees were artificially inoculated using a suspension of 10,000 B. xylophilus in 600 μl of tap water per tree. For the population dynamics investigation, the pines were divided into 48 segments for nematode extraction. The development of wilt symptoms as well as physiological changes were observed until tree death.During the population dynamics investigation, B. xylophilus was located at the inoculation site and in adjacent segments during the first 11 days after inoculation. On day 16, B. xylophilus was distributed throughout the entire stem, adjacent branch segments, root collar and roots before any external wilt symptoms appeared. With increasing pine wilt disease, B. xylophilus was finally found in all wood and root segments. High nematode densities appeared. Shortly before tree death, the treetop showed several nematode-free segments. The rest of the stem and adjacent branch segments and root collar were highly nematode-infested. During the pathogenicity investigation, all B. xylophilus-inoculated pines died within 84 days. The significant decline in the water potential in the needles was steeper and more strongly correlated with increasing wilt symptoms compared to a drought-stressed variant. However, the decline in the water potential in the needles started earlier in the drought-stressed pine variant. In conclusion, the population dynamics of B. xylophilus in seven- to eight-year-old P. sylvestris trees and the pathological reactions of the pines were comparable to those observed in assays with saplings, although delayed in reaching a population peak and developing wilt symptoms. Therefore, P. sylvestris saplings are good indicator trees for B. xylophilus population dynamics and pathogenicity investigations