Protéomique du cancer du sein : du différentiel au fonctionnel

De l'approche différentielle destiné à l'identification de marqueurs à l'analyse fonctionnelle pour la mise en évidence de cibles thérapeutiques, la protéomique apporte de nouvelles données fondamentales pour la compréhension des mécanismes de la cancérogenèse mammaire et des perspectives pour la clinique. Néanmoins la protéomique, comme l'ensemble des approches de post-génomique, doit faire face à la complexité cellulaire et moléculaire de la glande mammaire qui reste un défi majeur

Neurotrophins and their receptors in breast cancer

Growth factors of the neurotrophin family and their receptors have been mainly studied in the nervous system, but they are also expressed in carcinomas, and in breast cancer they significantly impact tumor cell growth and metastasis through various signaling pathways. Nerve growth factor and its precursor proNGF, brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-4/5 stimulate breast cancer cells through an autocrine loop involving the tyrosine kinase receptors TrkA, TrkB as well as its truncated form TrkB.T1 and the p75^NTR death receptor. Preclinical studies have shown that targeting neurotrophins and their receptors induce an inhibition of breast cancer cell survival, proliferation and invasion. Furthermore, targeting neurotrophins may also decrease tumor-induced cancer pain and this additional effect further strengthens their clinical relevance

Expression de sites de fixation des "Fibroblast growth factors" (FGFs) acide et basique au cours du developpement du cerveau de poulet

SIGLEINIST T 75014 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Protéomique fonctionnelle en oncologie Comprendre plus que décrire [Functional proteomics in oncology: to understand more than to describe.]

International audienceLike other -omics, proteomics is traditionally understood as a method that allows a global description of molecular content (here proteins) of a biological sample, used to identify new biomarkers in diseases such as cancers. Proteomics is also a powerful tool to identify the molecular mechanisms of diseases. In cancer, deregulation of cell growth and migration is related to alterations in cell signalling and the numerous alterations in protein-protein and protein-nucleic acid interactions that account for the malignant phenotype are only partly understood. Based on its capacity to separate and identify proteins, including those with post-translational modifications, proteomics provides new ways to understand post-genomic events that contribute to transformation and to identify new therapeutic targets

Le ProNGF dans le cancer du sein

Le NGF (nerve growth factor), membre prototypique des neurotrophines, a été largement décrit pour son rôle dans le système nerveux où il active la survie et la différenciation neuronale via son récepteur tyrosine kinase TrkA et le récepteur commun à toutes les neurotrophines p75NTR. Plus récemment, il a été décrit que le précurseur du NGF, le proNGF, peut être sécrété et induire la mort neuronale en se liant à p75NTR et à la sortiline. Plusieurs études ont montré l implication des neurotrophines dans la pathologie tumorale et les travaux pionniers de notre laboratoire ont démontré plus particulièrement l effet mitogénique et l action anti-apoptotique du NGF dans le cancer du sein. Néanmoins, aucune donnée n a été rapportée concernant le rôle du proNGF dans ce cancer, c est pourquoi nous avons décidé de mener cette étude. Nous avons démontré que le proNGF est produit et sécrété par les cellules cancéreuses mammaires. Ainsi, des western-blots ont permis de mettre en évidence une bande de 25 kDa qui diminue après transfection de siRNA contre le proNGF. De plus, par immunocytochimie, nous avons observé que le proNGF est localisé dans des vésicules intracellulaires qui sont libérées suite à un traitement avec un inducteur de sécrétion comme la ionomycine. En outre, le proNGF est détecté par spectrométrie de masse dans le milieu conditionné des cellules cancéreuses. Par ailleurs, en analysant 1423 biopsies humaines normales et cancéreuses par immunohistochimie, nous avons observé, en comparaison avec les tissus bénins et normaux, une surproduction du proNGF dans les cellules épithéliales mammaires cancéreuses associée avec l envahissement lymphatique. De façon intéressante, en utilisant des chambres de Boyden, nous avons validé, in vitro, nos observations concernant la métastase lymphatique, en montrant que le proNGF permet de stimuler la migration et l invasion des cellules cancéreuses de façon autocrine. Enfin, l invalidation de ses récepteurs a révélé le rôle essentiel de la sortiline pour conduire l effet pro-invasif du proNGF alors que nos données ont montré que p75NTR n intervenait pas. En conclusion, notre travail démontre que le proNGF est produit dans les tumeurs mammaires où il stimule l invasion des cellules cancéreuses mammaires participant ainsi au processus métastatique. De plus amples investigations précliniques et cliniques devront être menées afin de déterminer la valeur pratique du proNGF comme un marqueur et/ou cibleNerve growth factor (NGF), the prototypical neurotrophin, has extensively been studied for its role in the nervous system where it activates neuron survival and differentiation through the tyrosine kinase receptor TrkA and the neurotrophin receptor p75NTR. More recently, it was described that the precursor of NGF (proNGF) can be secreted and elicits neuronal apoptosis by engaging with p75NTR and sortilin receptors. Outside of the nervous system, several studies have indicated the implication of neurotrophins in tumors and in particular, our laboratory was pioneer in demonstrating the pro-survival and mitogenic effects of NGF for breast cancer cells. Nevertheless, nothing was reported about the role of the proNGF in breast cancer and this is what we have studied here. We demonstrated that proNGF was produced and secreted by breast cancer cells. Western blots analysis revealed a 25 kDa band that was decreased after transfection with siRNA against proNGF. Immunocytochemical observation showed proNGF localization in intracellular vesicles which were released upon treatment with the inducer of secretion ionomycin and proNGF was detected by mass spectrometry in conditioned medium of breast cancer cell. In addition, immunohistochemical analysis of 1423 normal vs human tumor biopsies showed proNGF overproduction in the epithelial compartment of malignant tumors when compared with benign and normal tissues, with a relationship to lymph node metastasis. Interestingly, in vitro, using Boyden chambers and RNA interference we showed that proNGF was a potent autocrine stimulator of breast cancer cell migration and invasion. Besides, impairment of its receptors revealed the essential role of sortilin in conducting proNGF pro-invasive effect whereas p75NTR was found not involved. In conclusion, our work demonstrates that proNGF is produced in breast tumors where it can stimulate cancer cell invasion, hence participating to metastasis. Further preclinical and clinical investigations will now have to be performed to determine the practical value of proNGF as a marker and/or therapeutic target.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Protéomique fonctionnelle de la signalisation de la kinase AKT dans le cancer du sein

LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Stimulation autocrine de la croissance des cellules du cancer du sein par le Nerve Growth Factor

Plus d'un demi siècle d'études sépare la mise en évidence de l'effet neurotrophique du Nerve Growth Factor (NGF) sur les neurones de la découverte de ses effets stimulateurs de la croissance du cancer du sein. Notre laboratoire a précédemment montré que le NGF est mitogène et anti-apoptotique pour les cellules de cancer du sein via ses deux catégories de récepteurs membranaires : p140TkrA (tyrosine kinase) et p75NTR (membre de la famille du TNF-R). Dans le présent travail, nous montrons pour la première fois que le NGF est synthétisé, puis libéré par les cellules cancéreuses. Ceci a été montré in vitro, en culture de cellules, et in vivo, dans les biopsies tumorales. Cette expression de NGF est spécifique des cellules cancéreuses, puisque les cellules épithéliales mammaires normales ne produisent pas ce facteur de croissance. Ceci indique la valeur marqueur potentielle du NGF dans le cancer du sein. De plus, nous montrons la présence du NGF dans des vésicules de sécrétion, indiquant l'existence d'un mécanisme de stockage et de libération de ce facteur de croissance. Enfin, à l'aide d'inhibiteurs spécifiques et d'anticorps, nous avons montré que le NGF libéré par les cellules de cancer du sein est biologiquement actif et qu'il stimule de façon autocrine la croissance des ces cellules. Nous avons aussi montré que le 4-OH-tamoxifène inhibe l'effet mitogène du NGF par induction d'une tyrosine phosphatase FAP-1/ PTPL1, en inhibant la phosphorylation de p140TrkA et des MAPKs. Une analyse protéomique préliminaire nous a permis d'identifier des partenaires moléculaires potentiels de FAP-1. Nous avons ensuite démontré que la voie de signalisation de p75NTR nécessite la fixation de TRADD (TNF-R associated death domain protein) pour l'obtention de l'effet stimulateur de la survie des cellules tumorales par le NGF. En conclusion, nos résultats montrent que le NGF et sa signalisation sont des marqueurs et des cibles thérapeutiques potentielles dans le cancer du sein.Plus d'un demi siècle d'études sépare la mise en évidence de l'effet neurotrophique du Nerve Growth Factor (NGF) sur les neurones de la découverte de ses effets stimulateurs de la croissance du cancer du sein. Notre laboratoire a précédemment montré que le NGF est mitogène et anti-apoptotique pour les cellules de cancer du sein via ses deux catégories de récepteurs membranaires : p140TkrA (tyrosine kinase) et p75NTR (membre de la famille du TNF-R). Dans le présent travail, nous montrons pour la première fois que le NGF est synthétisé, puis libéré par les cellules cancéreuses. Ceci a été montré in vitro, en culture de cellules, et in vivo, dans les biopsies tumorales. Cette expression de NGF est spécifique des cellules cancéreuses, puisque les cellules épithéliales mammaires normales ne produisent pas ce facteur de croissance. Ceci indique la valeur marqueur potentielle du NGF dans le cancer du sein. De plus, nous montrons la présence du NGF dans des vésicules de sécrétion, indiquant l'existence d'un mécanisme de stockage et de libération de ce facteur de croissance. Enfin, à l'aide d'inhibiteurs spécifiques et d'anticorps, nous avons montré que le NGF libéré par les cellules de cancer du sein est biologiquement actif et qu'il stimule de façon autocrine la croissance des ces cellules. Nous avons aussi montré que le 4-OH-tamoxifène inhibe l'effet mitogène du NGF par induction d'une tyrosine phosphatase FAP-1/ PTPL1, en inhibant la phosphorylation de p140TrkA et des MAPKs. Une analyse protéomique préliminaire nous a permis d'identifier des partenaires moléculaires potentiels de FAP-1. Nous avons ensuite démontré que la voie de signalisation de p75NTR nécessite la fixation de TRADD (TNF-R associated death domain protein) pour l'obtention de l'effet stimulateur de la survie des cellules tumorales par le NGF. En conclusion, nos résultats montrent que le NGF et sa signalisation sont des marqueurs et des cibles thérapeutiques potentielles dans le cancer du sein.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Proteomic analysis of the tumor suppressor p53 (post-translational modifications and protein partners)

La protéine suppresseur de tumeurs p53, est impliquée dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire et est également la protéine la plus mutée dans les cancers. Les mécanismes de régulation de l'activité de p53 impliquent des modifications post-traductionnelles et des protéines partenaires pour lesquelles les données de la littérature sont pléthoriques et fragmentaires. Dans la présente étude, nous avons développé une approche de protéomique basée sur l'immunoprécipitation et la spectrométrie de masse pour étudier les modifications post-traductionnelles de p53 et identifier ses protéines d'interaction. Dans un premier temps nous avons séquencé la totalité de la protéine p53 immunoprécipitée des cellules du modèle Cos-1. Cette expérience nous a permis d'identifier plusieurs sites de phosphorylations déja connus sur les serines: S15, S33, S315 et S392. Nous avons également identifié des acétylations sur les lysines suivantes: K305, K370, K372, K373, K381 et K382. C'est la première fois que des acétylations sont reportées pour la proteine p53 isolée des cellules Cos-1. De plus, il est reporté pour la toute première fois l'existence d'acétylation sur les résidus 319, 357 et 386. Dans un second temps, nous avons recherché les protéines qui se fixent sur p53 dans les cellules épithéliale mammaire non cancéreuse (MCF10A) versus les cellules cancéreuse (MCF7). Nos résultats identifient un certain nombre de partenaires potentiels de p53 et montrent pour la première fois que l'inhibiteur de serine protéase Maspine est capable de former un complexe avec p53. Ce complexe nucléaire est retrouvé exclusivement dans les cellules non cancéreuses MCFlOA et pourrait constituer un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de p53.The tumor suppressor protein p53 is involved in many signaling pathways and is the most frequently mutated protein in cancers. The mechanisms for the regulation of p53 activity involve post-translational modifications and partner proteins for which literature is phletoric and fragmentary. ln the present study, we have developed a proteomics approach, coupling immunoprecipitation and mass spectrometry, to investigate p53 post-translational modifications and protein partners. First, we sequenced the full p53 protein immunoprecipitated from the Cos-l cells. This lead to the identification and localization of several known phosphorylations on serine residues S 15, S33, S315 and S392 as weIl as several known acetylations on lysine residues: K305, K370, K372, K373, K381 and K382. Acetylation sites are being reported for the tirst time on monkey p53 from Cos-l cells on lysine 319,357 and 386. Second, we looked for partner proteins that can bind to p53 in non cancerous (MCFlOA cells) versus cancerous (MCF7) human breast epithelial cells. Our results report a series of putative interacting partners among which the serine protease inhibitor maspin. The complex between p53 and maspin was validated by westem-blotting, localized in the nucleus and found in the noncancerous MCFlOA cells only. The p53/maspin interaction could represent a new regulatory mechanism for the activity of p53.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Apport de l'analyse protéomique à l'étude de la signalisation du fibroblast growth factor-2 dans les cellules de cancer du sein

Nous avons etudie la signalisation intracellulaire du fibroblast growth factor-2 dans les cellules de cancer du sein mcf-7 par analyse proteomique basee sur le couplage de l'electrophorese bidimensionnelle et de la spectrometrie de masse (maldi-tof et ms-ms). A l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques et d'anticorps, nous avons montre que la stimulation des cellules mcf-7 par le fgf-2 declenche une augmentation de la tyrosine-phosphorylation du recepteur de haute affinite du fgf-2, du fgf receptor substrate-2 , de la kinase src, des p42/p44 mitogen-activated protein kinases (mapk), et d'une proteine de 30 kda. L'analyse en spectrometrie de masse maldi-tof nous a permis d'identifier cette proteine de 30 kda comme etant la cycline d2, element majeur de la regulation du cycle cellulaire. De plus, nos resultats suggerent que la phosphorylation de la cycline d2 est dependante de src mais pas des mapk. Nous avons ensuite etudie les modifications de synthese de proteines induites par le fgf-2 apres incorporation d'acides amines marques au 3 5s. Nous avons montre une augmentation de synthese de 4 proteines ( heat shock proteins hsp90 et hsp70, proliferating cell nuclear antigen (pcna) et transcriptionaly controlled tumor protein (tctp)) qui ont ete identifiees par spectrometrie de masse maldi-tof et ms-ms.De plus, ces 4 proteines sont constitutivement surexprimees dans les cellules mcf-7 transfectees par l'oncogene ras. L'inhibition de la proliferation induite par le fgf-2 par la geldanamycine souligne l'importance de l'hsp90 dans la croissance des cellules de cancer du sein et son emergence comme cible therapeutique potentielle. Enfin, l'analyse proteomique des cellules cancereuses mammaires nous a permis de mettre en evidence pour la premiere fois que la quantite de la proteine 14-3-3 sigma est diminuee dans les cellules cancereuses par rapport aux cellules normales. La 14-3-3 sigma ayant ete tres recemment impliquee dans le controle de la progression du cycle cellulaire, ces donnees suggerent que cette proteine pourrait constituer un nouveau marqueur de cancerisation des cellules du sein. L'ensemble de ces travaux contribue a une meilleure comprehension du mecanisme d'action intracellulaire du fgf-2 dans les cellules de cancer du sein et montre les potentialites de l'analyse proteomique pour l'etude de la signalisation et plus generalement pour la recherche biomedicale.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF