Caracterização de plasmídeos de Staphylococcus epidermidis e correlação com a resistência a compostos antimicrobianos mediada por efluxo

Staphylococcus epidermidis coloniza a pele e mucosas do Homem e de animais, sendo considerado um importante agente patogénico oportunista em clínica humana e veterinária. Embora já estejam descritos diversos determinantes plasmídicos de resistência a compostos antimicrobianos nesta bactéria, a caracterização de plasmídeos de coleções alargadas de S. epidermidis e o seu papel na disseminação destas resistências é ainda relativamente escassa. O objectivo desta Dissertação foi identificar e caracterizar perfis plasmídicos de isolados comensais de S. epidermidis, correlacionando-os com a presença de genes de resistência a compostos antimicrobianos, com ênfase naqueles que codificam para bombas de efluxo. Para isso, estudou-se uma coleção de 112 S. epidermidis de colonização nasal em profissionais e estudantes de Medicina Veterinária. O DNA plasmídico foi isolado pelo método de lise alcalina e o perfil plasmídico determinado por digestão com a enzima de restrição EcoRI (RFLP). A detecção de genes plasmídicos que codificam para bombas de efluxo associadas a resistência a antibióticos (msrA, tetK, vga(A) e vga(C)), a biocidas (qacG, qacJ) e a metais pesados (cadA, cadD e arsB) foi realizada por PCR e a presença destes correlacionada com o perfil de resistência estabelecido em trabalhos anteriores. Este estudo permitiu demonstrar a presença de plasmídeos nos 112 isolados analisados, sendo a presença de plasmídeos de grandes dimensões (> 23 kb) predominante. A maioria dos isolados (66%) tinha dois ou mais plasmídeos. A análise por RFLP evidenciou uma grande heterogeneidade dos perfis plasmídicos. A pesquisa por PCR permitiu detectar o gene msrA em 35 de 57 isolados resistentes a macrólidos (61,4 %), o gene tet(K) em 25 dos 26 isolados resistentes à tetraciclina (96,2%), o gene vga(A) em 12 dos 19 isolados com resistência constitutiva à clindamicina (63,2%) e em 3 dos 19 com resistência indutível à clindamicina (15,8%) e o gene vga(C) em 15 dos 19 isolados com resistência constitutiva à clindamicina (78,9%) e em 15 dos 19 isolados com resistência indutível a este antibiótico (78,9%), naquela que deverá ser das primeira descrições deste gene em isolados de origem humana. Para os metais pesados, nomeadamente para o cádmio, apenas se detectou o gene cadA em 3 dos 112 isolados (2,7%), não se tendo identificado a presença do gene cadD. Por fim, nenhum isolado apresentou os genes qacJ e qacG, associados à susceptibilidade reduzida a biocidas e corantes. Este trabalho demonstra a elevada frequência de plasmídeos e de determinantes que conferem resistência por efluxo a antibióticos em estirpes de S. epidermidis de colonização nasal em humanos em contacto próximo com animais. O alargamento desta análise a outros genes de resistência, permitirá explorar a importância destes e dos plasmídeos que os transportam na disseminação de estirpes resistentes, com especial destaque para a ligação entre as vertentes humana e veterinária.Staphylococcus epidermidis colonizes the skin and mucous membranes of both Man and animals and it is considered to be an important opportunistic pathogen in human and animal medicine. Although several plasmid encoded determinants of antimicrobial resistance are known for this bacterium, the characterization of plasmids carried by large collections of S. epidermidis is scarce. The aim of this Dissertation was to identify and characterize plasmid profiles in S. epidermidis, correlating them with the presence of antimicrobial resistance genes, with emphasis on those coding for efflux pumps. In this work we studied a collection of 112 S. epidermidis of nasal colonization in professionals and students of Veterinary Medicine. Plasmid DNA was isolated by the alkaline lysis method and the plasmid profile determined by restriction with enzyme EcoRI (RFLP). Detection of plasmid genes encoding efflux pumps associated with resistance to antibiotics (msrA, tetK, vga(A) and vga(C)), biocides (qacG, qacJ) and heavy metal (cadA, cadD and arsB) was performed by PCR. The presence of these determinants was correlated with the resistance phenotypes previously established. This study demonstrated the presence of plasmids in the 112 isolates analyzed, with large plasmids (> 23 kb) predominating. The majority of the isolates (66%) carried two or more plasmids. RFLP analysis showed a great heterogeneity of the plasmid profiles. PCR screening detected the msrA gene in 35 out of 57 macrolide resistant isolates (61,4 %), the tet(K) in 25 of the 26 tetracycline resistant isolates (96.2%), the vga(A) in 12 of the 19 isolates with constitutive resistance to clindamycin (63,2%) and in 3 of 19 with inducible resistance to clindamycin (15.8%), whereas the vga(C) gene was identified in 15 of the 19 isolates with constitutive resistance (78.9%) and in 15 of the 19 isolates with inducible resistance to clindamycin (78.9%), in one of the first reports of vga(C) in humans. For heavy metals, particularly cadmium, the cadA gene was detected in 3 of 112 isolates (2.7%), while the cadD gene was not detected. Finally, no isolates showed the qacJ or qacG genes, associated with reduced susceptibility to biocides and dyes. This work demonstrates the high frequency of plasmids and determinants conferring efflux mediated resistance to antibiotics in S. epidermidis strains of nasal colonization in humans in close contact with animals. The extension of this analysis to other plasmid encoded resistance genes will allow exploring their importance in the dissemination of resistant strains, with particular emphasis on the link between the human and veterinary perspectives

Characterization of plasmid encoded efflux determinants from Staphylococcus epidermidis

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Emergence of non-wild-type populations towards biocides in Staphylococcus epidermidis colonizing veterinary staff

[P269]Aims: To characterize biocide susceptibility of Staphylococcus epidermidis colonizing veterinary staff; propose epidemiological cut-off (ECOFF) values; assess relationships between biocide and antibiotic resistance phenotypes.Methods: The susceptibility profiles of 112 S. epidermidis isolates from nasal colonization of veter-inary staff towards six biocides (including benzalkonium chloride, chlorhexidine and triclosan) and ethidium bromide (EtBr), was determined by microdilution MIC determination. The MIC distribu-tions were analyzed by the normalized resistance interpretation method and the iterative statistical method to determine ECOFF values. Antibiotic susceptibility was determined by disc diffusion and antimicrobial resistance determinants screened by PCR.Results: Analysis ofMIC distributions enabled the detection of non-wild-type (NWT) populations towards most biocides and to the efflux marker EtBr and the proposal of tentative ECOFF values for the compounds tested. The NWT populations were correlated with carriage of the plasmid-en-coded efflux pump genes qacA/B and/or smr. NWT populations to triclosan were correlated with sh-fabI gene. We observed high frequencies of methicillin resistance(mecA+, 61 %) as well as of multidrug resistance phenotypes (50 %). Several determinants were associated with resistance phenotypes, including blaZ, erm, vga and fus genes. Carriage of qacA/B and/or smr was statistically associated with MDR phenotypes. Conclusions: This study discloses the first tentative ECOFF values of several biocides for S. epider-midis. It also reveals a high prevalence of biocide and antibiotic resistant S. epidermidis colonizing humans in close contact with animals, suggesting that these bacteria can be reservoirs for antimi-crobial resistance.publishe

Antibiotic and biocide resistance in Staphylococcus epidermidis colonizing humans in close contact with animals

Oral communicationpublishe

Characterization of antimicrobial resistance in Staphylococcus epidermidis colonizing veterinary staff and students

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Perfil em alergénios do pólen de Platanus hybrida

Objetivos: O plátano (Platanus hybrida) é uma árvore frequentemente utilizada em ambiente urbano, com fins ornamentais. Sendo uma árvore de grande porte, produz pólen em grande quantidade. Embora seja responsável por níveis de exposição a pólen elevados no início da primavera, que são coincidentes com queixas da população, o seu potencial alergénico está pouco caracterizado. Este trabalho teve, assim, como objetivo caracterizar o perfil em alergénios do pólen de plátano na cidade de Évora, Alentejo. Métodos: Prepararam-se extratos de amostras de pólen de Platanus hybrida ou Dactylis glomerata utilizando tampão bicarbonato. Os extratos foram liofilizados e conservados a -80ºC. O conteúdo em proteínas foi determinado pelo método de Bradford. O perfil em alergénios foi avaliado por western blot utilizando soros humanos (obtidos mediante consentimento informado de doentes do Hospital do Espírito Santo de Évora – HESE). Resultados: Observou-se teste positivo a P. hybrida em metade dos soros testados. O perfil em proteínas de P. hybrida exibiu diversas bandas imunorreativas com massas moleculares compreendidas entre 10-90 kDa e com pI no intervalo 4,4-7,0. Foram encontradas imunorreativas comuns a Q. rotundifólia e/ou a D. glomerata. Duas bandas identificadas na gama de 50kDa e 60 kDa parecem específicas de P. hybrida. Também se registou reatividade cruzada com D. glomerata. Conclusões: Este trabalho evidencia alguns alergénios encontrados em pólen de P. hybrida. Para além disso mostra ainda a existência de reatividade cruzada com pólen de gramíneas. Estes resultados sugerem que o pólen de plátano, dada a sua grande abundância na cidade de Évora, poderá contribuir para o agravamento a sintomatologia da população que sofre de polinose, em particular no início da primavera. Agradecimentos: Este trabalho foi financiado por fundos do FEDER através do Programa Operacional Fatores de Competitividade – COMPETE”. Um agradecimento especial ao nosso colega, já falecido, Prof. Rui Brandão, pelo estímulo que deu a este trabalho e pela sua dedicação para a implementação e desenvolvimento da Aerobiologia na Universidade de Évora. Temos a honra de dedicar este trabalho à sua memória. Background and Aim: Although grasses and olive are the most relevant allergenic species in the Alentejo region, aggravation of allergic symptoms in the early spring, unrelated with those species pollen seasons, has been reported, particularly in urban environment. Plane trees, hence pollen, are highly abundant in the city of Évora, nonetheless allergen pollen profile has not yet been evaluated. The aim of this work was to characterize the allergen profile of pollen from Platanus hybrida, one of the most representative species in Evora showing pollination prior to the main pollen season in Alentejo. Methods: Pollen from Platanus hybrida, Quercus rotundifolia or Dactylis glomerata was extracted with ammonium bicarbonate buffer, lyophilized and stored at -80ºC until analysis. Protein content was determined by the Bradford method. SDS-PAGE followed by western blot, using allergic patient sera (obtained from the Hospital do Espírito Santo de Évora – HESE), were performed to evaluate the allergen profile of the pollen. Results: Protein profile of P. Hybrida has shown several bands in the Mr 10-90 kDa. Western blot have shown several immunoreactive bands. Protein profile according to the pI showed immunoreactive bands in the pI range 4.0-6.1. Cross-reactivity of P. hybrida with Q. rotundifolia and D. glomerata was found. Conclusion: These results evidenced allergens found in P. hybrida pollen. Moreover, cross–reactivity between P. hybrida and highly allergenic species such as D. glomerata was found which probably contributes for aggravation of pollinosis in the early spring. Acknowledgments: This work was supported by “FEDER - Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE”. A special acknowledgment to our colleague Prof. Rui Brandão, deceased, for his dedication to the present work, to the implantation and development of Aerobiology in the University of Évora. We have the honour of dedicating this work to the memory of Prof. Rui Brandão