Generation and application of monoclonal antibodies against rat thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI)

De geactiveerde vorm van Trombine Activeerbare Fibrinolyse Inhibitor (TAFIa) is een enzym met antifibrinolytische eigenschappen. TAFIa is een potentiële risicofactor voor cardiovasculaire aandoeningen omdat dit eiwit een belangrijke link vormt tussen bloedstolling en fibrinolyse. Aan de andere kant is specifieke inhibitie van TAFIa een veelbelovende strategie als adjuvans bij trombolytische therapie. De fysiopathologische rol van TAFI is echter nog niet volledig begrepen. De aanwezigheid van verschillende isovormen van TAFI in plasma verstoorden het resultaat van de verschillende technieken om het TAFI(a) gehalte in plasma te bepalen. Bijgevolg was het moeilijk om een link te creëren tussen TAFI en trombotische aandoeningen omdat het resultaat van de verschillende klinische studies contradictorisch bleek te zijn. Het gebruik van dierenmodellen kan helpen om de fysiopathologische rol van TAFI in vivo beter te begrijpen. Deze modellen zijn verder ook nuttig om potentiële TAFIa inhibitoren uit te testen en te evalueren voor therapeutisch gebruik. Het gebruik van deze dierenmodellen is echter wel nog ten dele verhinderd door (1) de nog ongekende verschillen in het fibrinolytisch systeem van de verschillende species en (2) de lage crossreactiviteit van de beschikbare antilichamen ter bepaling van humaan TAFI. In het eerste deel van deze studie werden recombinant rat- en muis-TAFI tot expressie gebracht en gekarakteriseerd en vergeleken met humaan TAFI om de verschillen tussen de species op te helderen (cf. chapter 2). Dit bracht aan het licht dat TAFI in deze drie species activeerbaar is door een proteolytische klieving door het trombine-trombomoduline complex na Arg92, resulterend in een actief carboxypeptidase: TAFIa (36 kDa). TAFIa van deze drie species bleek ook een temperatuursafhankelijke instabiliteit te bezitten die belangrijk is voor de downregulatie van TAFIa. Tenslotte werd aangetoond dat TAFIa bij alle species een antifibrinolytisch effect bezit in in vitro klonterafbraak. Deze biochemische karakteristieken zijn cruciaal voor de rol van TAFIa in de fibrinolyse en wijzen op een gelijkaardige functie en regulatie van TAFI(a) in de muis, rat en mens.De werking van plasmine was wel verschillend en wees op Arg147 als primaire klievingplaats in rat-TAFI. De absolute enzymstabiliteit was ook verschillend (bv. rat- en muis-TAFIa zijn significant minder stabiel dan humaan TAFIa) wat resulteert in een kleiner antifibrinolytisch potentieel van muis en rat-TAFIa versus humaan TAFIa (cf. chapter 3). Interessant hierbij is evenwel dat de 50 % klonterafbraak tijden in muis- en ratplasma langer zijn vergeleken met humaan plasma. Rat-TAFIa werd ook gestabiliseerd door de introductie van vier puntmutaties (i.e. S305C-T329I-H333Y-S335Q), wat aanleiding gaf tot een 7,5-voudige stijging van de halfwaardetijd van rat-TAFIa en een 10-voudige verlenging van de 50 %-klonterafbraak. Gelijkaardige mutaties stabiliseerden humaan TAFIa echter 120-voudig, wat erop wijst dat andere regio s verantwoordelijk zijn voor de stabiliteit in rat-TAFIa versus humaan TAFIa.Deze verschillen in species moeten in rekening gebracht worden bij het extrapoleren van data van rat- en muismodellen naar de mens, zeker bij het evalueren van TAFIa modulatoren. In het tweede deel van deze studie werden in TAFI-deficiënte muizen monoklonale antilichamen (MA s) gericht tegen rat-TAFI aangemaakt (i.e MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5, MA-RT36B2 and MA-RT82F12) (cf. chapter 4 and 6). Bepaalde MA s kunnen gebruikt worden voor de opzuivering van TAFI d.m.v. affiniteitchromatografie (i.e. MA-RT36A3F5) en voor Western blot experimenten (i.e. MA-RT36B2). Verder werden er drie sandwich-type ELISAs (i.e. MA-RT36A3F5/MA-RT30D8-HRP, MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP and MA-RT82F12/MART36A3F5-HRP) (cf. Chapter 3) ontworpen, die gebruikt kunnen worden om rat- en muizen-TAFI in plasma te kwantificeren. Daarmee leveren we als eerste een methode om TAFI in plasma van ratten en muizen te kunnen bepalen. De MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP werd reeds toegepast in een studie waarin de rol van TAFI tijdens leverregeneratie werd bestudeerd. Er werd echter geen essentiële rol van TAFI tijdens leverregeneratie vastgesteld. Specifieke inhibitoren van TAFI(a) zouden als adjuvans bij trombolytische therapie gebruikt kunnen worden. Bestaande TAFI inhibitoren zijn vaak niet specifiek genoeg, niet selectief ten opzichte van plasma carboxypeptidase N, of ze vertonen een stabiliserend effect op TAFIa. Monoklonale antilichamen zijn zeer specifieke molecules, die een inhiberend effect kunnen vertonen. Daarom hebben we in het derde deel van deze studie de interactie van de MA s met de activiteit en de stabiliteit van rat-TAFIa en hun invloed op de klonterafbraak in vitro bestudeerd (cf. chapter 6). Vier MA s (i.e. MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5 and MA-RT82F12) vertoonden een profibrinolytisch effect tijdens de klonterafbraak in vitro, waarbij twee verschillende werkingsmechanismen vastgesteld werden: MA-RT13B2 en MA-RT36A3F5 destabiliseren de rat-TAFIa-molecule, MA-RT30D8 en MA-RT82F12 daarentegen blokkeren ofwel de toegang tot het actief centrum ofwel verstoren ze de interactie met de bloedklonter. Verder konden we ook de bindingsplaatsen van de inhiberende MA s bepalen en daarmee nieuwe moleculaire doelwitten voor de inhibitie van (rat)-TAFIa ophelderen (i.e. Arg227 voor MA-RT13B2, Arg188 en His192 voor MA-RT36A3F5 en Ser249, Ser251, Tyr260 en Arg227 voor MA-RT30D8 and MA-RT82F12, respectievelijk). Samengevat, werden tijdens dit onderzoek species specifieke verschillen tussen TAFI van knaagdieren (i.e. ratten en muizen) en humaan TAFI opgehelderd. Er werden ook tal van tools gegenereerd, die op antilichamen gebaseerd zijn en die gebruikt kunnen worden om TAFI in vivo te bestuderen. Verder beschrijven we MA s die profibrinolytische eigenschappen vertonen en de functie van (rat)-TAFIa door verschillende werkingsmechanismen inhiberen. Deze MA s, en mogelijke derivaten ervan, zullen nuttig zijn voor toekomstig TAFI-onderzoek. Tenslotte hebben we nieuwe moleculaire doelwitten voor de directe inhibitie van (rat)-TAFIa opgehelderd. Dit is van belang voor de toekomstige ontwikkeling van inhibitoren van TAFIa voor therapeutische toepassingen.Acknowledgements I Table of contents III List of publications VII List of abbreviations VIII Chapter 1 : General Introduction 1 1.1 Antibodies 3 1.1.1 Structure of antibodies 3 1.1.2 Monoclonal antibodies and their production 4 1.1.3 In vitro applications of monoclonal antibodies 5 1.1.4 Therapeutic antibodies 6 1.2 The Haemostatic system 8 1.2.1 The coagulation cascade 8 1.2.2 The fibrinolytic cascade 10 1.3 Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) 10 1.3.1 Discovery and nomenclature 10 1.3.2 Classification 11 1.3.3 3D-model of the structure 12 1.3.4 Catalytic mechanism 14 1.3.5 Genomic organisation of the TAFI gene (CPB2) 15 1.3.6 TAFI synthesis and distribution 16 1.3.7 TAFI activation 17 1.3.8 Inactivation of TAFIa 17 1.3.9 TAFI(a) inhibition 19 1.4 The Physiological role of TAFI 19 1.4.1 TAFI in fibrinolysis 19 1.4.2 TAFI in thrombotic and bleeding disorders 22 1.4.3 TAFI in other (patho)physiological processes 23 1.5 TAFI measurement 25 1.5.1 Antigen assays 25 1.5.2 Activity based assays 25 1.6 Goal of the study 28 Chapter 2 : Characterization of rat Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor – a comparative study assessing the biological equivalence of rat, murine and human TAFI 29 2.1 Introduction 31 2.2 Material and Methods 32 2.2.1 Plasma 32 2.2.2 Production of recombinant TAFI 33 2.2.3 Evaluation of TAFI fragments generated upon incubation with T/TM or plasmin 34 2.2.4 TAFIa activity measurement 34 2.2.5 Thermal stability of rat TAFIa 35 2.2.6 Deglycosylation 35 2.2.7 Clot lysis assay 35 2.2.8 Cross-reactivity of monoclonal antibodies raised against human TAFI 36 2.3 Results 36 2.3.1 Expression and purification TAFI 36 2.3.2 Glycosylation of TAFI 36 2.3.3 TAFI fragments generated upon incubation with T/TM or plasmin 37 2.3.4 Activation of TAFI 38 2.3.5 Thermal stability of TAFIa 39 2.3.6 Effect of TAFIa on in vitro clot lysis time 39 2.3.7 Cross-reactivity of monoclonal antibodies against human TAFI 40 2.4 Discussion 41 2.5 Acknowledgements 44 2.6 References 44 Chapter 3 : Conformational (In)Stability of rat TAFIa versus human TAFIa 47 3.1 Introduction 49 3.2 Results and Discussion 49 3.3 Acknowledgements 52 3.4 References 52 Chapter 4 : Development of sandwich-type ELISAs for the quantification of rat and murine TAFI in plasma 55 4.1 Introduction 57 4.2 Material and Methods 58 4.2.1 Plasma 58 4.2.2 Production of recombinant TAFI 59 4.2.3 Production of monoclonal antibodies towards rat TAFI 59 4.2.4 Construction of a sandwich-type ELISA for the detection of rat TAFI 59 4.2.5 TAFIa activity measurement 59 4.2.6 Correlation between TAFI antigen levels and TAFIa activity 60 4.2.7 Statistical analysis 60 4.3 Results 61 4.3.1 Generation of monoclonal antibodies 61 4.3.2 Construction of ELISAs 61 4.3.3 Specificity, sensitivity and linearity 61 4.3.4 Reactivity towards native TAFI in plasma 61 4.3.5 Variability and recovery 62 4.3.6 Correlation between antigen levels and TAFIa activity 62 4.3.7 Reactivity towards rat TAFI and rat TAFIa 63 4.3.8 Determination of TAFI antigen levels in rat and murine plasma 63 4.4 Discussion 64 4.5 Acknowledgements 67 4.6 References 67 Chapter 5 : The role of TAFI in liver regeneration 71 5.1 Introduction 73 5.2 Material and Methods 74 5.2.1 Animals and diet 74 5.2.2 Partial hepatectomy 74 5.2.3 mRNA quantification 75 5.2.4 TAFI antigen determination 75 5.2.5 TAFIa and CPN activity measurement 75 5.2.6 Statistical analysis 76 5.3 Results 76 5.3.1 Liver weight 76 5.3.2 TAFI antigen and activity levels 77 5.3.3 Relative changes of TAFI antigen and TAFI mRNA 77 5.3.4 Relative changes of CPN activity and CPN mRNA 78 5.4 Discussion 79 5.5 Acknowledgements 82 5.6 References 82 Chapter 6 : Discovery of novel mechanisms and molecular targets for the inhibition of TAFIa 85 6.1 Introduction 87 6.2 Experimental procedures 88 6.2.1 Materials 88 6.2.2 Monoclonal antibodies towards rat TAFI 89 6.2.3 Production of recombinant TAFI 89 6.2.4 Production of (rat)TAFI variants 89 6.2.5 Cross-reactivity 90 6.2.6 Surface plasmon resonance analysis 90 6.2.7 Evaluation of the direct inhibitory effect of MAs on rat TAFIa 90 6.2.8 Evaluation of the effect of MAs on rat TAFIa stability 90 6.2.9 Evaluation of the effect of MAs during in vitro clot lysis 91 6.2.10 Statistical analysis 91 6.3 Results - Part I: Basic characterization of MAs 91 6.3.1 Affinity of MAs towards rat, murine and human TAFI 91 6.3.2 Inhibitory effect of MAs on TAFIa activity 92 6.3.3 Effect of MAs on rat TAFIa stability 93 6.3.4 Effect of MAs on clot lysis 94 6.4 Results - Part II: Elucidation of binding sites and mechanism of inhibition 95 6.4.1 Interaction of rat TAFI with two MAs 95 6.4.2 Reactivity of MAs with TAFI chimeras 95 6.4.3 Generation of rat TAFI single mutants 96 6.4.4 Characterization of rat TAFI single mutants 96 6.5 Discussion 98 6.6 References 101 Chapter 7 : General discussion 105 Summary 119 Samenvatting 121 Zusammenfassung 125 References 129 Curriculum vitae 137status: publishe

Development of sandwich-type ELISAs for the quantification of rat and murine thrombin activatable fibrinolysis inhibitor in plasma

BACKGROUND: Altered plasma levels of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) are associated with a large number of pathologies. Rat and murine models are frequently used to study the pathophysiological role of TAFI in vivo but immunological tools to quantify rat and murine TAFI are lacking. OBJECTIVE: The production of monoclonal antibodies (mAb) towards rat TAFI and the development of an ELISA for the quantification of rat and murine TAFI in plasma. METHODS AND RESULTS: Monoclonal antibodies were raised in TAFI-deficient mice towards (activated) recombinant rat TAFI. Pair-wise testing of the mAb revealed three suitable ELISA combinations, namely RT36A3F5/RT30D8-HRP, RT36A3F5/RT82F12-HRP and RT82F12/RT36A3F5-HRP. All three ELISAs are highly specific for rat and murine TAFI. TAFI concentrations in the lower ng mL(-1) range can be determined in plasma samples with a high reproducibility. Comparing TAFI antigen levels measured by these ELISAs with TAFIa activity values determined by activity based assays revealed excellent correlations (R(2) > 0.98). The average antigen levels of 20 individual rat plasma samples were 16 +/- 2 microg mL(-1) using the RT36A3F5-RT30D8-HRP, 12 +/- 2 microg mL(-1) using the RT36A3F5-RT82F12-HRP and 21 +/- 2 microg mL(-1) using the RT82F12-RT36A3F5-HRP ELISA. The determined antigen levels in rat plasma are similar to the levels reported for human plasma. CONCLUSIONS: We developed three highly specific and extremely sensitive sandwich-type ELISAs for the quantification of rat and murine TAFI in plasma. The described ELISAs will facilitate in vivo investigation on the pathophysiological role of TAF