Helicobacter pylori lipopolysaccharide modification, Lewis antigen expression, and gastric colonization are cholesterol-dependent

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p><it>Helicobacter pylori </it>specifically takes up cholesterol and incorporates it into the bacterial membrane, yet little is currently known about cholesterol's physiological roles. We compared phenotypes and <it>in vivo </it>colonization ability of <it>H. pylori </it>grown in a defined, serum-free growth medium, F12 with 1 mg/ml albumin containing 0 to 50 μg/ml cholesterol.</p> <p>Results</p> <p>While doubling times were largely unaffected by cholesterol, other overt phenotypic changes were observed. <it>H. pylori </it>strain SS1 grown in defined medium with cholesterol successfully colonized the stomach of gerbils, whereas SS1 grown without cholesterol failed to colonize. <it>H. pylori </it>lipopolysaccharide often displays Lewis X and/or Y antigens. Expression of these antigens measured by whole-cell ELISA was markedly enhanced in response to growth of strain SS1, 26695, or G27 in cholesterol. In addition, electrophoretic analysis of lipopolysaccharide in wild type G27 and in mutants lacking the O-chain revealed structural changes within the oligosaccharide core/lipid A moieties. These responses in Lewis antigen levels and in lipopolysaccharide profiles to cholesterol availability were highly specific, because no changes took place when cholesterol was substituted by β-sitosterol or bile salts. Disruption of the genes encoding cholesterol α-glucosyltransferase or lipid A phosphoethanolamine transferase had no effect on Lewis expression, nor on lipopolysaccharide profiles, nor on the cholesterol responsiveness of these properties. Disruption of the lipid A 1-phosphatase gene eliminated the effect of cholesterol on lipopolysaccharide profiles but not its effect on Lewis expression.</p> <p>Conclusions</p> <p>Together these results suggest that cholesterol depletion leads to aberrant forms of LPS that are dependent upon dephosphorylation of lipid A at the 1-position. A tentative model for the observed effects of cholesterol is discussed in which sequential steps of lipopolysaccharide biogenesis and, independently, presentation of Lewis antigen at the cell surface, depend upon membrane composition. These new findings demonstrate that cholesterol availability permits <it>H. pylori </it>to modify its cell envelope in ways that can impact colonization of host tissue <it>in vivo</it>.</p

Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen – Verfahrensentwicklung, Produktcharakterisierung und Erprobung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen sowie der Verfahrensentwicklung und Charakterisierung einzelner Prozesse und Zwischenprodukte. Insbesondere geht diese Ausarbeitung auf Grenzflächenphänomene in kolloidalen Systemen ein, die für pharmazeutische Anwendungen relevant sind. Fernerhin ist die Erprobung von Wirkstoffen auf zellulärer Ebene ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Arbeit. Die zentrifugale Herstellung von Liposomen aus Nanoemulsionen nach Pautot et.al. [1, 2] zeigt, dass der Transport von wässrig dispergierter Phase aus der Ölphase in eine unterliegende Wasserphase prinzipiell möglich ist. Der Nachweis erfolgt durch die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Emulgators sowie der Untersuchung der beteiligten Phasen mittels dynamischer Lichtstreuung. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass Phospholipide, welche im Öl gelöst sind, nach der Zentrifugation nur zu maximal 5% in dieser ursprünglich gelösten Phase verbleiben. Daraus und aus den Informationen der Analyse der wässrigen Phase nach der Zentrifugation kann abgeleitet werden, dass sich die Phospholipide zu mindestens 50% an dem Aufbau der Grenzfläche zwischen Wasser und Öl, zur Stabilisierung der Emulsionströpfchen, beteiligen. Die Ergebnisse der Charakterisierung der gebildeten Partikel, welche nach der Zentrifugation in der Wasserphase zu finden sind, weisen darauf hin, dass das Verfahren in seiner technologisch realisierten Form, basierend auf dem Prozess von Pautot et.al. [1, 2], nicht zu den gewünschten Einkapselungseffizienzen führt. Es ergaben sich präzisierte Aufgabenstellungen sowie offene Fragen zur exakten Bildung von Phospholipid-Mono- bzw. Doppelschichten, welche hinsichtlich der Stabilität der Grenzflächen maßgeblich sind. Der Transport der Wasser-in-Öl Emulsionen in die unterliegende Wasserphase führt vermutlich zu einer Deformation der Emulsionströpfchen, bevor diese an der Phasengrenze von einer zweiten Phospholipidschicht ummantelt werden, was in einer ungewollten Freisetzung von Wirkstoff resultiert. Dies äußert sich in Partikeln oder Liposomen, die im Durchschnitt etwa die Hälfte der Partikelgröße der zuvor erzeugten Emulsionen aufweisen sowie in Einkapselungseffizienzen von etwa 25%. Um ein besseres Verständnis über das Adsorptionsverhalten der Emulgatormoleküle, den Phospholipiden, zu erreichen, liegt der Fokus dieser Arbeit auf tensiometrischen Untersuchungen an der Wasser/Öl-Grenzfläche. Diese Analysen liefern einen Einblick in die Flächendichte der Moleküle an der Phasengrenze, was zur Optimierung und späteren Realisierung stabiler Lipidschichten im Zentrifugationsprozess ohne zu hohen Wirkstoffverlust, von Bedeutung ist. Die Charakterisierung der Struktur und des Aufbaus von Schichten adsorbierter Phospholipidmoleküle, an der Grenzfläche zwischen Wasser und einer zweiten organischen Phase, erfolgt mit Hilfe der Tropfen-Profilanalyse Tensiometrie (PAT). Mittels PAT werden Untersuchungen von Phospholipiden unterschiedlicher Sättigung in den verschiedenen pharmazeutisch relevanten Ölphasen Squalen und Squalan durchgeführt, die Rückschlüsse über die Packungsdichte adsorbierter Moleküle zulassen. In Abhängigkeit von der Sättigung der Ölphasen, in denen die Phospholipide gelöst sind, lassen sich darüber hinaus klare Indizien für eine Monoschichtbildung in der ungesättigten Phase Squalen und für eine Multischichtbildung in der gesättigten Phase Squalan ableiten. Dieses Ergebnis erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Stabilität von Emulsionen, was jedoch in dieser Arbeit nicht Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die systematische Variation der Tropfenphase und der umgebenden Phase bei der tensiometrischen Analyse ergibt zudem signifikante Unterschiede, die in vergleichender Form noch nicht in der Literatur beschrieben sind. Um deren Ursache aufzuklären und um verifizierte tensiometrische Messergebnisse zu erhalten, kommt zusätzlich Chloroform mit dem Phospholipid DPPC als Referenz zum Einsatz, das als gut beschriebenes Stoffsystem gilt. Durch diese ergänzenden Betrachtungen, auch mit Hilfe weiterer Messmethoden wie der dynamischen Lichtstreuung, Kernspinresonanzspektroskopie und Phosphatanalytik, ist die Ursache für diese Messunterschiede näher beschreibbar. Es wurde eine Abreicherung von Phospholipiden aus der Ölphase in die Wasserphase beobachtet, die stärkere Auswirkungen auf die Phospholipidkonzentration aufweist, wenn das lipidhaltige Reservoir die um den Faktor 100 kleinere Volumenphase darstellt. Dies ist in dem in der Literatur ausschließlich verwendeten Messaufbau, eines Phospholipid-haltigen Öltropfens in 100-fach größeren umgebenden Wasserphasenvolumen, der Fall. Aus diesem Grund kann mit dem invertierten tensiometrischen Messaufbau eines Wassertropfens in Öl eine Empfehlung gegeben werden, der diese Artefakte ausschließt bzw. minimiert. Die systematische Analyse an der Grenzfläche zweier kaum mischbarer Phasen vermittelt ein umfangreiches Verständnis über das Löslichkeits- und Adsorptionsverhalten von Phospholipiden in den verwendeten pharmazeutischen Ölen Squalen und Squalan. Eine erhöhte Löslichkeit ungesättigter Phospholipide gegenüber gesättigten Phospholipide im ungesättigten Öl lässt sich auf mögliche Lösemittel-Phospholipid-Interaktionen, an den jeweiligen Doppelbindungen der beiden Moleküle (π-π-Interaktionen), zurückführen. Des Weiteren wird die Anwesenheit oxidativer Verunreinigungen von Squalen genauer untersucht, ein mehrstufiges Aufreinigungsverfahren etabliert und die Auswirkungen dieser Verunreinigungen in Form einer erhöhten Löslichkeit gesättigter Phospholipide beschrieben. Die beobachtete Löslichkeitserhöhung wird im Zusammenhang mit physiologischen Emulsionen, den sogenannten Lipoproteinen, und deren Beteiligung an pathologischen Vorstufen der Entstehung von Arteriosklerose diskutiert. Dies geschieht ebenfalls unter dem Aspekt möglicher Interaktionen zwischen dem Phospholipid und der Ölphase sowie deren Einfluss auf die Stabilität von Lipoproteinen im menschlichen Körper und deren medizinischer Relevanz. Informationen zur Zytotoxizität unterschiedlicher Wirkstoffe sowie zur Sensitivität verschiedener Tumorentitäten sind für die Durchführung von in vivo-Versuchen von essentiellem Interesse. Daher wird unverkapselter Wirkstoff, pharmazeutisch zugelassener Präparate aus Viscum album (der weißbeerigen Mistel), zur Erprobung auf Tumorzellen verwendet. Dies sind Pflanzenextrakte, die abhängig von der verwendeten Wirtspflanze, auf denen die Mistel wächst, Unterschiede in ihrer Viscotoxin (VT)- und Mistellektin (ML)-Zusammensetzung aufweisen. abnobaVISCUM® (aV) Fraxini, Quercus und Pini, welche in ihrer ML-Konzentration sowie ML-Isoform stark variieren, wurden in vitro auf murinen Zelllinien untersucht. Die Durchführung von Zellproliferationstests dient zur Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration der aV Präparate und zur Auswahl möglichst sensitiver Zelllinien für in vivo-Experimente. aV Pini, das den niedrigsten ML-Gehalt, jedoch überwiegend die ML-Isoform III aufweist, zeigt eine deutlich stärkere Inhibierung der Zellproliferation der Melanomzellen B16-F10 und der Makrophagen RAW264.7 als im Vergleich zu den ML-reicheren Präparaten aV Fraxini und Quercus. Zusätzlich wird die Wirkung von extrahiertem ML I, welches aus Rohmaterial von der Esche gewonnen wurde, in einer vergleichenden in vitro Studie untersucht. Obwohl das getestete ML I für alle untersuchten Zelllinien zytotoxischen ist, sind in Abhängigkeit vom Zelltyp deutliche Unterschiede beobachtbar. Die murinen Dickdarmkarzinomzellen der Zelllinie C26 zeigen dabei die höchste Empfindlichkeit auf das isolierte ML I und sind daher für nachfolgende in vivo Versuche zu empfehlen

Phospholipids as emulsifiers für micro/nano droplets suitable for biotechnological systems integration

We studied the emulsifying properties of palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine (POPC) using the biocompatible compounds water and squalene as immiscible fluid phases. We tested the solubility limit of POPC in squalene and its equilibrium distribution between bulk phases. POPC is dissolvable in squalene up to 0.3% (w/v) with an ultrasonication procedure. Above this limit, aggregates of >1 μm are formed which are resistant to prolonged ultrasonication in size and quantity. Emulsifying properties of POPC were elaborated by measuring the droplet size ranges of emulsions. Nanofluidics was studied by pressure driven transport of nanometer sized emulsion droplets through defined nanochannels whereby droplet sizes 500 nm can be produced. The mechanical properties of the emulsifying phospholipid monolayer at the water/squalene interface were studied by profile analysis tensiometry (PAT). The dynamic interfacial tension was measured and the adsorption isotherms were established from long-time approximations of the diffusion-controlled adsorption. With PAT a critical aggregation concentration was determined in the same range as the solubility limit, which was measured by dynamic light scattering. The minimum interfacial tension for POPC as emulsifier was found to be below 1 mN/m. Thus, it can be concluded that phospholipids are suitable emulsifiers for microfluidics and produce adsorbed layers of remarkably small interfacial tension

Implementing integrated care: a synthesis of experiences in three European countries

Many countries are experimenting with new models to better integrate care; yet, innovative care models are often implemented as time-limited, localised projects with limited impact on service delivery more broadly. This paper seeks to understand the processes behind successful projects that achieved some form of ‘routinisation’ and informed system-wide integrated care strategies. It draws on detailed case studies of three integrated care experiments: the ‘Integrated effort for people living with chronic diseases’ project in Denmark; the Gesundes Kinzigtal network in Germany; and Zio, a care group in the Maastricht region in the Netherlands. It explores how they were developed, implemented and sustained, and how they impacted the wider system context. All three models implicitly or explicitly adopted processes shown to be conducive to the dissemination of innovations, including dedicated time and resources, support and advocacy, leadership and management, stakeholder involvement, communication and networks, adaptation to local context and feedback. Each showed robust evidence of improvements on a number of service and patient outcomes and these findings were central to their wider impacts, shaping country-wide integrated care polices. However, the wider dissemination of projects occurred in an incremental and somewhat haphazard way. To further redesign health and social care a more formal strategy, alongside resources, may thus be needed to provide funders and providers with genuine incentives to invest in new business models of care. There remains a crucial need for better understanding of specific local conditions that influence implementation and sustainability to enable translation to other contexts and settings

Large-scale analysis of protein expression changes in human keratinocytes immortalized by human papilloma virus type 16 E6 and E7 oncogenes

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Infection with high-risk type human papilloma viruses (HPVs) is associated with cervical carcinomas and with a subset of head and neck squamous cell carcinomas. Viral E6 and E7 oncogenes cooperate to achieve cell immortalization by a mechanism that is not yet fully understood. Here, human keratinocytes were immortalized by long-term expression of HPV type 16 E6 or E7 oncoproteins, or both. Proteomic profiling was used to compare expression levels for 741 discrete protein features.</p> <p>Results</p> <p>Six replicate measurements were performed for each group using two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE). The median within-group coefficient of variation was 19–21%. Significance of between-group differences was tested based on Significance Analysis of Microarray and fold change. Expression of 170 (23%) of the protein features changed significantly in immortalized cells compared to primary keratinocytes. Most of these changes were qualitatively similar in cells immortalized by E6, E7, or E6/7 expression, indicating convergence on a common phenotype, but fifteen proteins (~2%) were outliers in this regulatory pattern. Ten demonstrated opposite regulation in E6- and E7-expressing cells, including the cell cycle regulator p16^INK4a; the carbohydrate binding protein Galectin-7; two differentially migrating forms of the intermediate filament protein Cytokeratin-7; HSPA1A (Hsp70-1); and five unidentified proteins. Five others had a pattern of expression that suggested cooperativity between the co-expressed oncoproteins. Two of these were identified as forms of the small heat shock protein HSPB1 (Hsp27).</p> <p>Conclusion</p> <p>This large-scale analysis provides a framework for understanding the cooperation between E6 and E7 oncoproteins in HPV-driven carcinogenesis.</p

Correlates of absolute and excessive weight gain during pregnancy

OBJECTIVE: Factors associated with weight gain during pregnancy that may be linked to maternal overweight and obesity were examined. METHODS: In this observational study, 144 women reported on demographics, (prepregnancy) body weight, and lifestyles in self-reported questionnaires at 30 weeks gestation. Body weight at the end of pregnancy (self-reported at 6 weeks postpartum) was used to determine total gestational weight gain. Multivariate prediction models were developed to identify factors associated with total gestational weight gain and excessive gestational weight gain (i.e., higher weight gain than recommended by the Institute of Medicine). RESULTS: Women gained 14.4 (+/-5.0) kg during pregnancy. Obese women gained almost 4 kg less than normal weight women. Pregnant women judging themselves to be less physically active or women who reported increased food intakes during pregnancy gained significantly more weight. Over one third of women (38%) gained more weight than recommended. Being overweight, judging yourself to be less physically active than others, and a perceived elevated food intake during pregnancy were significantly associated with excessive weight gain (odds ratio [OR] = 6.33, 95% confidence interval [CI]: 2.01-19.32; OR = 3.96, 95% CI: 1.55l, 10.15; and OR = 3.14, 95% CI: 1.18, 8.36, respectively). A higher age at menarche and hours of sleep reduced the odds for excessive weight gain (OR = 0.75, 95% CI: 0.57, 0.99; and OR = 0.35, 95% CI: 0.57, 0.93, respectively). CONCLUSIONS: Mean hours of sleep, perceived physical activity, and measures of food intake at 30 weeks gestation were identified as modifiable behavioral correlates for excessive gestational weight gain. Strategies to optimize gestational weight gain need to be explored, with a focus on the identified factors

Genetic microheterogeneity and phenotypic variation of Helicobacter pylori arginase in clinical isolates

BACKGROUND: Clinical isolates of the gastric pathogen Helicobacter pylori display a high level of genetic macro- and microheterogeneity, featuring a panmictic, rather than clonal structure. The ability of H. pylori to survive the stomach acid is due, in part, to the arginase-urease enzyme system. Arginase (RocF) hydrolyzes L-arginine to L-ornithine and urea, and urease hydrolyzes urea to carbon dioxide and ammonium, which can neutralize acid. RESULTS: The degree of variation in arginase was explored at the DNA sequence, enzyme activity and protein expression levels. To this end, arginase activity was measured from 73 minimally-passaged clinical isolates and six laboratory-adapted strains of H. pylori. The rocF gene from 21 of the strains was cloned into genetically stable E. coli and the enzyme activities measured. Arginase activity was found to substantially vary (>100-fold) in both different H. pylori strains and in the E. coli model. Western blot analysis revealed a positive correlation between activity and amount of protein expressed in most H. pylori strains. Several H. pylori strains featured altered arginase activity upon in vitro passage. Pairwise alignments of the 21 rocF genes plus strain J99 revealed extensive microheterogeneity in the promoter region and 3' end of the rocF coding region. Amino acid S232, which was I232 in the arginase-negative clinical strain A2, was critical for arginase activity. CONCLUSION: These studies demonstrated that H. pylori arginase exhibits extensive genotypic and phenotypic variation which may be used to understand mechanisms of microheterogeneity in H. pylori

A Gene Optimization Strategy that Enhances Production of Fully Functional P-Glycoprotein in Pichia pastoris

Structural and biochemical studies of mammalian membrane proteins remain hampered by inefficient production of pure protein. We explored codon optimization based on highly expressed Pichia pastoris genes to enhance co-translational folding and production of P-glycoprotein (Pgp), an ATP-dependent drug efflux pump involved in multidrug resistance of cancers.Codon-optimized "Opti-Pgp" and wild-type Pgp, identical in primary protein sequence, were rigorously analyzed for differences in function or solution structure. Yeast expression levels and yield of purified protein from P. pastoris (∼130 mg per kg cells) were about three-fold higher for Opti-Pgp than for wild-type protein. Opti-Pgp conveyed full in vivo drug resistance against multiple anticancer and fungicidal drugs. ATP hydrolysis by purified Opti-Pgp was strongly stimulated ∼15-fold by verapamil and inhibited by cyclosporine A with binding constants of 4.2±2.2 µM and 1.1±0.26 µM, indistinguishable from wild-type Pgp. Maximum turnover number was 2.1±0.28 µmol/min/mg and was enhanced by 1.2-fold over wild-type Pgp, likely due to higher purity of Opti-Pgp preparations. Analysis of purified wild-type and Opti-Pgp by CD, DSC and limited proteolysis suggested similar secondary and ternary structure. Addition of lipid increased the thermal stability from T(m) ∼40 °C to 49 °C, and the total unfolding enthalpy. The increase in folded state may account for the increase in drug-stimulated ATPase activity seen in presence of lipids.The significantly higher yields of protein in the native folded state, higher purity and improved function establish the value of our gene optimization approach, and provide a basis to improve production of other membrane proteins